本文是一篇作物種植技術研究論文，發表在《麥類作物學報》上，雜志是由教育部主管、西北農林科技大學和國家小麥工程技術研究中心聯合主辦的學術期刊，也是全國唯一的一份學術性麥類作物�？�，國內外公開發行。其前身為農業部主管的譯文刊物《國外農學—麥類作物》，1981年創刊，1997年更名為技術性中文期刊《麥類作物》，2000年又被科技部批準更名為《麥類作物學報》。

　　采用微生物修復農藥污染的方法，從武漢市江夏區長期受有機磷農藥污染的土壤中馴化、分離、篩選出幾株生長最具優勢的降解有機磷農藥毒死蜱的菌株，分析和研究了單菌株和復合菌株對土壤的降解效果。實驗結果表明，在7種組合和2個空白對照的對比下，AB菌株組合成為最佳組合降解菌，證明在實驗環境中確實存在菌種間的相互作用來促進其對農藥的降解，且降解效果明顯。另外，研究了不同溫度、PH值、碳源、氮源等環境因子對優勢菌株生長的影響。

　　毒死蜱(Chlorpyrifos)，即氯吡硫磷，作為一種中毒性有機磷殺蟲劑類農藥， 作用效果好，藥效持續時間長，在我國乃至世界都有著廣泛的使用，目前逐漸替代高毒性有機磷農藥。在施用中，會殘留于土壤、水、作物葉片上。如果不及時處理，會隨著揮發性和移動性富集于生物體內，最后隨著生物鏈進入人體，危害人體健康。目前對于農藥污染的研究有很多，對毒死蜱也是如此。通過對他人研究成果的分析，筆者發現“研究過多的集中在一種高效降解菌的提取和研究”，即人們研究的高效降解菌株多局限于一株，然而單一的菌株易受土壤環境和土著微生物的影響，降解效率極易下降，并且土壤中的微生物環境極其復雜，降解農藥污染不是一株降解菌就可以降解到人們滿意的效果。筆者從長期使用受機磷農藥污染的農田取樣，以含有毒死蜱農藥的培養基篩選耐性菌株。通常情況下，在較高濃度的培養基中會出現多種耐性菌種，在多次循環使用農藥培養基培養后，菌種會逐漸穩定，其中極有可能出現含有毒死蜱抗性的降解菌株。然后通過組合培養可以確定復合菌株能否提高分解效率，以期證明環境中確實存在菌種間的相互作用來促進其對農藥的降解，研究結果可以為農藥污染的土壤生物修復相關研究提供一定的依據。

　　2 材料與方法

　　2.1 實驗材料

　　土樣：取自江夏區長期受有機磷農藥污染的田地中，風干，避光保存。

　　農藥：毒死蜱(美國陶氏益農公司登記注冊)

　　2.2 試劑及設備

　　(1)試劑 KH2PO4，MgSO4·7H2O，(NH4)2SO4，蔗糖，HCl，NaOH，革蘭氏染色試劑，瓊脂，牛肉膏，乙酸乙酯。

　　(2)儀器設備 PGX-250多段光照培養箱(寧波);UV-1800紫外-可見分光光度計(日本);奧林巴斯BX51顯微鏡(日本);光照恒溫搖床(上海)。

　　(3)富集培養基(液體)配方：K2HPO4·3H2O 13.3g，KH2PO4 4g，MgSO4·7H2O 0.2g，(NH4)2SO4 0.5g，蔗糖10g，水1000mL，PH 7.0。

　　(4)牛肉膏蛋白胨培養基(液體)配方：牛肉膏 3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，水 1000mL，PH 7.5。

　　(5)農藥儲備液：準確移取毒死蜱農藥，用乙酸乙酯為溶劑配制成質量濃度為0.5g/L的毒死蜱農藥儲備液，于冰箱中保存，使用時根據實際需要配置成不同濃度的標準工作液。

　　2.3 實驗方法

　　2.3.1 菌種的篩選、分離和提純方法

　　土壤樣品來自江夏區紙坊附近的農田，取2g新鮮土壤加入98g蒸餾水，搖勻制成懸浮液。取懸浮液的25%加入到含有一定量毒死蜱的培養基中，放入搖床中震蕩培養，30℃，100r/min轉培養48小時。48小時后移取懸浮液500微升于50mL含有一定量的毒死蜱的培養基中，然后在搖床繼續培養48小時，條件一致，重復3次。采用平板劃線法分離菌種，通過多次分離，在顯微鏡下觀察細菌形態確定得到三株優勢菌種，暫命名為A菌，B菌，C菌，分別挑取A、B、C，接種于50mL富集培養基中，30℃，120r/min，振蕩培養24h(富集培養)，得到三種純的菌液備用。

　　2.3.2 不同組合菌株降解毒死蜱的土壤模擬實驗方法

　　實驗土壤取回后風干過40目篩備用。采用a、b、c三個處理組，每個處理組重復兩次。向每個錐形瓶中加入50 g土壤，25mL水，作如下處理：

　　a 組：1、滅菌、加入A菌懸液6mL、農藥儲備液2mL;2、滅菌、加入b菌懸液6mL、農藥儲備液2mL;3、滅菌、加入c菌懸液6mL、農藥儲備液 2mL;4、滅菌、加入a、b菌懸液各3 mL、農藥儲備液2mL;5、滅菌、加入a、c菌懸液各3 mL、農藥儲備液2mL;6、滅菌、加入b、c菌懸液各3 mL、農藥儲備液2mL;7、滅菌、加入a、b、c菌懸液各2 mL、農藥儲備液2mL;

　　b 組：滅菌、未加入菌懸液，加入農藥儲備液2 mL;

　　c 組：未滅菌、未加入菌懸液，加入農藥儲備液2 mL。

　　其中，b、c兩組均為空白對照組，b組為了測定土壤和農藥之間的吸附關系，c組為了測定土壤固有微生物和農藥之間的降解關系。需要滅菌的樣品放入高壓滅菌鍋中，121℃條件下滅菌30min。將滅菌后的樣品和C組樣品放入30℃振蕩培養箱中培養，其間分別在第1、4、7、11、15、21天取樣，用紫外可見分光光度計測定各對應組別對毒死蜱的降解率。每周向A處理組中加入對應等量的菌懸液，并于試驗期間每隔3天進行稱重和補足流失水分，保證試驗期間土壤中總含水量維持在一個較穩定的水平。

　　2.3.3 降解純菌株及復合菌株的生理生化特性研究

　　將分離出的優勢降解菌株利用革蘭氏染色法，在生物數碼顯微鏡下觀察菌體形態大小。在優勢菌株的培養過程中，通過對培養基配制不同的PH值、碳源、氮源，設定不同的培養溫度，采用不同的接種方式，研究環境因子(氧氣，PH值，溫度，碳源和氮源)對優勢菌株生長的影響。

　　2.4 毒死蜱提取及其測定方法

　　2.4.1 毒死蜱標準曲線

　　配制濃度分別為0.0001mg/mL、0.0002mg/mL、0.001mg/mL、0.002mg/mL、0.005mg/mL的毒死蜱溶液，采用紫外分光光度計于293mm波長下測定各濃度溶液的吸光度，繪出吸光度-濃度標準曲線。

　　2.4.2 土壤中毒死蜱的殘留提取方法

　　稱取1.0g土壤，加入少量乙酸乙酯，充分搖勻混合，混合物用濾紙過濾，過濾前撒上少量無水硫酸鈉以吸收土樣中的水分，過濾過程中多次加入乙酸乙酯于試管中沖洗，最后定容至5毫升。采用紫外分光光度計于293mm波長下測定吸光度。

　　3 實驗結果與分析

　　3.1 各處理組菌株降解結果與分析

　　由圖1、圖2可知，培養第一天，各個處理組的殘留量減少約一半，初始添加量均為0.5mg，共九個處理組在添加農藥一天后均下降為0.2mg 左右，在此初步認為是土壤顆粒的吸附所致。由于土壤的吸附性，毒死蜱滴入土壤中后迅速被吸附并進入顆粒內部，而乙酸乙酯在常規手段下難以有效溶解吸附在顆粒內部的毒死蜱，導致無法析出，因而在測定時含量下降。在第3天即第2次測量時除a3組含量降低不明顯，其他幾組含量均有較大幅度下降，下降趨勢相似。第 8天測量時，b組濃度出現回升，可能是土壤吸附的毒死蜱重新釋放回土壤所致，a6組與b組變化趨勢相近。除a3組外其他各組均出現持續下降，說明添加菌種均對毒死蜱產生降解效應，但是否確實為降解還無法確定。培養至第21天，毒死蜱殘留量出現不同程度下降，其中a4、a5、a1組與b、c組相比下降尤為明顯，殘留量分別為0.114mg、0.138 mg、0.164 mg。殘留量由高到低排序為a3>b>a2>a6>a7>b>a1>a5>a4，即降解量 a4>a5>a1>c>a7>a6>a2>b>a3，而降解量前三的組別中均有菌種A，由此可以斷定菌種A確實對毒死蜱具有一定的吸收或降解能力，而相比于A菌種單獨或與其他菌種的組合，A菌種與B菌種的組合在降解效率上顯得尤為突出。這一結果表明，本次實驗最終篩選得到的最優組合為AB菌種組合，對于其他組合，除a3無明顯效果外，均呈現出比B組(空白組)降解效果好的趨勢，而并未呈現出比C組(全菌種模擬野外環境組合)具有更明顯優勢的趨勢，說明篩選出的A、B、C三個菌種中A菌、B菌具有吸收或降解能力，而C菌無明顯吸收或降解能力。

　　3.2 優勢菌株生理生化特性研究結果與分析

　　3.2.1 顯微形態

　　A菌株為革蘭氏陰性菌，菌體為長桿狀，有鞭毛，有芽孢，菌落圓形，淡黃色，不透明，凸起，邊緣整齊;b菌株為革蘭氏陰性菌，菌體為短桿狀，無鞭毛，無芽孢，菌落圓形，淡黃色，不透明，凸起，邊緣整齊;c菌株為革蘭氏陽性菌，菌體為短桿狀，無鞭毛，無芽孢，菌落圓形，淡黃色，不透明，凸起，邊緣整齊。

　　3.2.2 氧氣和溫度對分離菌株的影響

　　A、B菌株在只在試管的表面處生長，因此A、B菌均為專性好氧菌。c菌株在試管的接近表面處和表面處生長，因此C菌為兼性厭氧菌。

　　由表1可以看出，單菌株的最適宜生長溫度在30-37℃，高于45℃或低于4℃菌株不生長;AB復合菌株的最適宜生長溫度在15-37℃，高于45℃或低于4℃菌株不生長。此復合菌株對溫度的適應能力稍強于單菌株對溫度的適應能力，說明復合菌株更能適應自然條件。

　　3.2.3 PH值、碳源和氮源對菌株的生長的影響

　　由圖3可以看出，當PH在5-9之間時，A、B、C和復合菌株三個菌株生長情況較好，PH在9以后，各菌株的生長情況隨著PH的增大而減小;復合菌株在不適宜生長的PH為2、4、10時的OD600均稍高于每一個單菌株，可以看出，復合菌株更加適宜在自然條件下生長。

　　由圖4可知，A菌株和復合菌株在以蔗糖為唯一碳源時，生長量最好，下面依次為葡萄糖、淀粉、毒死蜱。而B菌株和C菌株在以葡萄糖為唯一碳源時，生長量最好，下面依次為毒死蜱、蔗糖、淀粉。但A菌株和復合菌株對上述碳源都可以進行降解，且降解率差異不大，這樣更有利于自然環境中的生長。

　　由圖5可知，A菌株和B菌株在以蛋白胨為唯一氮源時，生長量最好，下面依次為牛肉膏、毒死蜱、酵母膏。C菌株在以牛肉膏為唯一氮源時，生長量最好，下面依次為蛋白胨、毒死蜱、酵母膏。這說明，在有其他營養物質作為氮源時，降解菌首先降解其他物質，但是在有毒死蜱存在時，這些菌株的生長量差別不是很大，所以對毒死蜱的降解影響不大。復合菌株在以蛋白胨為唯一氮源時，生長量最好，下面依次為毒死蜱、牛肉膏、酵母膏，可以看出復合菌株對毒死蜱有較好的降解效果。

　　4 結論和建議

　　在單菌株處理組中，菌株a對毒死蜱的降解效果最好;復合菌株處理組中，菌株ab對毒死蜱的降解效果最好。在9組菌株處理組中，AB菌種組合成為最佳組合，證明在實驗環境中確實存在菌種間的相互作用來促進其對農藥的降解，效果明顯。生理生化研究表明，a菌種為專性好氧菌，在30℃，PH為8，蔗糖為唯一碳源，蛋白胨為唯一氮源的條件下時，對毒死蜱的降解量最高;ab組合菌種在30℃，PH為8，蔗糖為唯一碳源，蛋白胨為唯一氮源的條件下時，對毒死蜱的降解量最高。

　　由于實驗時間和實驗條件所限，實驗還需繼續深入，例如相關三個菌種之間的相互作用，降解效果定量分析，菌種定量搭配分析，菌種生物學鑒定等還需要進一步研究。