摘要:通過(guò)研磨法和涂布平板法對(duì)山藥(Dioscorea batatas Decne)不同部位的內(nèi)生菌進(jìn)行分離,共獲得34株菌株,并對(duì)這些菌株作拮抗性篩選和生物學(xué)特性分析。結(jié)果表明,有4株菌株對(duì)枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)具有明顯的抑菌效果,抑制率均在24%以上,其中菌株HNSQSY04的抑制率最大,達(dá)52%;有1株菌株對(duì)大腸桿菌 (Escherichia coli)有抑菌效果。對(duì)篩選出的4株菌株做了革蘭氏染色和芽孢染色、菌體大小和生長(zhǎng)曲線等特性分析,表明HNSQSY04的特征符合芽孢桿菌屬,HNSQSY14、HNSQSY24和 HNSQSY31均有桿菌的特征。

　　關(guān)鍵詞:農(nóng)業(yè)期刊論文投稿格式,山藥(Dioscorea batatas Decne),內(nèi)生菌,抑菌活性,分離,篩選

　　Isolation and Screening of Endophytes with Inhibition Activity

　　from Chinese Yam Rhizomes

　　ZHAO Long-fei

　　(College of Life Sciences, Shangqiu Normal University, Shangqiu 476000, China)

　　Abstract: A total of 34 endophytes were isolated from different parts of Chinese yam rhizomes by grinding method and spread plate method. Inhibition activity against pathogens and its biological characteristics were analyzed. The results showed that four strains preliminarily screened had obvious inhibition to Bacillus subtilis, with inhibition rates of above 24%. Strain HNSQSY04 had the maximum inhibition rate of 52%. One strain had inhibition activity to Escherichia coli. Gram staining, spore staining, growth curve of four strains screened were analyzed. Results showed that HNSQSY14, HNSQSY24, and HNSQSY31 had Bacillus genus features. HNSQSY04 had the features of the genus Gracilibacillus.

　　Key words: yam rhizome; endophyte; inhibition activity; isolation; screening

　　植物內(nèi)生菌(Endophyte)是指一類在其部分或全部生活史中存活于健康植物各種組織內(nèi)部或細(xì)胞間隙，而不使宿主產(chǎn)生明顯病理癥狀的微生物[1]。植物是內(nèi)生菌的宿主并給內(nèi)生菌提供營(yíng)養(yǎng)，內(nèi)生菌則產(chǎn)生具有一定生物活性的次生代謝產(chǎn)物，如植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、抑菌劑、殺蟲物質(zhì)、抗病毒成分等[2]，與植物形成共生互利關(guān)系，產(chǎn)生一定的生物防治和穩(wěn)定生態(tài)環(huán)境的作用[3]。將植物內(nèi)生菌作為生物防治菌不僅可避免因使用化學(xué)農(nóng)藥給環(huán)境帶來(lái)的污染，還可避免殺死非靶標(biāo)微生物和破壞植物根際土壤的微生態(tài)平衡，在防治植物病害方面有較大的應(yīng)用潛力，成為國(guó)內(nèi)外微生物研究的熱點(diǎn)之一[3-5]。

　　山藥(Dioscorea batatas Decne)為薯蕷科(Dioscoreaceae)薯蕷屬(Dioscorea)多年生草質(zhì)藤本植物薯蕷的塊根，是中國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源植物。它含有豐富的DHEA、蛋白質(zhì)、糖類、黏液質(zhì)、皂苷、維生素、膽堿、淀粉酶、糖蛋白、氨基酸、多酚氧化酶等成分。一些研究對(duì)山藥的內(nèi)生細(xì)菌和真菌進(jìn)行了分離和篩選[2，6-8]，但鮮見(jiàn)對(duì)河南山藥病原菌拮抗性內(nèi)生菌系統(tǒng)研究的報(bào)道。本研究以河南山藥為試驗(yàn)材料，篩選對(duì)細(xì)菌具拮抗作用的內(nèi)生菌，并進(jìn)行微生物學(xué)鑒定，以獲取其基本信息，為山藥拮抗菌的利用提供理論依據(jù)。

　　1材料與方法

　　1.1材料

　　1.1.1山藥惠樓山藥,來(lái)自于河南省商丘市虞城惠店集鄉(xiāng)樓村(砂壤土);鐵棍山藥,來(lái)自河南省焦作市溫縣(黏土)。

　　1.1.2試劑草酸銨結(jié)晶紫、盧戈氏碘液、番紅、次氯酸鈉、無(wú)水乙醇、孔雀石綠等。

　　1.1.3培養(yǎng)基 LB固體培養(yǎng)基:NaCl 10 g,酵母膏5 g,蛋白胨10 g,瓊脂10 g,補(bǔ)水至1 000 mL,pH 7.2~7.4,121 ℃滅菌 20 min [9]。液體培養(yǎng)基不加瓊脂。

　　牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基:牛肉膏3.0 g,蛋白胨10.0 g,NaCl 5.0 g,補(bǔ)水至1 000 mL,pH 7.2~7.4,121 ℃滅菌20 min[9]。固體培養(yǎng)基另加瓊脂10 g。

　　高氏1號(hào)培養(yǎng)基:可溶性淀粉20 g,KNO3 1.0 g,NaCl 0.5 g,K2HPO4・3H2O 0.5 g, MgSO4・7H2O 0.5 g,FeSO4・7H2O 0.01 g,瓊脂20 g,補(bǔ)水至1 000 mL,pH 7.4~7.6,121 ℃滅菌30 min[9]。

　　1.2方法

　　1.2.1材料的表面消毒分別取山藥的底部、中部、上部,先用無(wú)菌水沖洗2~3次;把山藥放入75%乙醇中30 s,迅速取出再放入5%的次氯酸鈉中3~8 min,然后用無(wú)菌水沖洗5~8次。最后一次沖洗過(guò)各部位的水用移液槍分別吸取500 μL涂平板,檢測(cè)表面消毒是否徹底。

　　1.2.2內(nèi)生菌的分離、純化和保藏經(jīng)表面消毒的山藥組織2 g放入無(wú)菌研缽中,研磨至黏稠漿狀[6],向研缽中加入18 mL無(wú)菌水,攪拌均勻,即制成10-1的菌懸液。取不同部位的山藥研磨液,分別稀釋成10-2、10-3、10-4 3個(gè)梯度。分別取山藥不同部位研磨液的稀釋液500 μL涂布平板,3個(gè)重復(fù)。置入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中30 ℃倒置培養(yǎng),觀察、記錄結(jié)果。挑取單菌落,以劃線分離法接種到培養(yǎng)基上28 ℃倒置培養(yǎng)24 h后鏡檢觀察。重復(fù)操作,直至獲得純菌株。

　　1.2.3拮抗菌的篩選和鑒定

　　1)病原菌的活化。大腸桿菌(Escherichia coli CGMCC1.1103)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis CGMCC1.769),為商丘師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)教研室保藏。

　　將大腸桿菌和枯草芽孢桿菌以平板劃線法轉(zhuǎn)接到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上,置于培養(yǎng)箱中28 ℃倒置培養(yǎng),活化后分別轉(zhuǎn)接到牛肉膏蛋白胨斜面上,待斜面長(zhǎng)飽滿后暫時(shí)保藏于4 ℃冰箱備用。

　　2)拮抗菌篩選。采用濾紙片法[10]篩選對(duì)病原菌有抑制作用的內(nèi)生菌。制備大腸桿菌菌懸液,用移液槍吸取200 μL涂布牛肉膏蛋白胨平板。在平板上均勻放置4個(gè)直徑1.00 cm的圓形濾紙片,在濾紙片上加10 μL內(nèi)生菌懸液,以滴加10 μL無(wú)菌水的作為空白對(duì)照,30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)。枯草芽孢桿菌的操作方法同大腸桿菌。觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果,選取具有抑菌效果的菌株復(fù)篩。復(fù)篩以相同方法進(jìn)行,培養(yǎng)72 h后測(cè)抑菌圈直徑(含濾紙片),每株菌3個(gè)重復(fù)。

　　3)抑菌效果的計(jì)算。病原細(xì)菌抑菌效果用抑制率衡量,抑制率=(處理抑菌圈直徑-濾紙片直徑) /濾紙片直徑×100%[11]。

　　4)拮抗菌株形態(tài)學(xué)鑒定。參照參考文獻(xiàn)[9],對(duì)內(nèi)生菌分別進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色、菌體形態(tài)和大小等的測(cè)定。

　　5)拮抗菌的生長(zhǎng)特征。把篩選出的內(nèi)生細(xì)菌接種到滅菌的LB液體培養(yǎng)基中,恒溫振蕩培養(yǎng)箱28 ℃ 130 r/min培養(yǎng),每隔2 h取樣一次,持續(xù)44 h。在波長(zhǎng)為600 nm處測(cè)光密度。以光密度值(OD600 nm)為縱坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1內(nèi)生菌的分離情況

　　鐵棍山藥和惠樓山藥的不同部位共分離34株菌株,根據(jù)菌落特征初步判斷其32株為細(xì)菌,2株為放線菌。

　　2.2拮抗菌的篩選和鑒定情況

　　對(duì)山藥中分離的34株菌株進(jìn)行抑菌篩選試驗(yàn)(圖1、圖2),篩選出4株拮抗菌株,其抑菌情況見(jiàn)表1。

　　從表1可見(jiàn), HNSQSY04、HNSQSY14、HNSQSY24、HNSQSY31對(duì)枯草桿菌都有抑制作用,抑制率均在24%以上,其中HNSQSY04的抑制率最大,達(dá)52%。HNSQSY31對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出抑制作用且效果不明顯,抑制率僅為12%,其他3株對(duì)大腸桿菌沒(méi)有抑制作用。

　　2.3菌株形態(tài)學(xué)鑒定情況

　　菌株形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果見(jiàn)表2、表3、圖3。由表2、表3可知,拮抗菌分別分離自惠樓山藥的底部、上部以及鐵棍山藥的中部。篩選出的4株菌株的顏色不一致, 菌落都較為濕潤(rùn)、易挑取;菌株HNSQSY04和HNSQSY31來(lái)自惠樓山藥,菌落較小,邊緣不規(guī)則,且菌落較薄,革蘭氏染色分別呈紫色、紅色,細(xì)胞都呈桿狀,且前者有芽孢(圖3);HNSQSY14和HNSQSY24來(lái)自鐵棍山藥,菌落較大,邊緣規(guī)則,呈乳白色和淺棕色,革蘭氏染色呈紅色,為革蘭氏陰性菌,無(wú)芽孢。

　　2.4拮抗菌的生長(zhǎng)特征

　　拮抗菌的生長(zhǎng)特征見(jiàn)圖4。菌株HNSQSY04和HNSQSY24的潛伏期較短,4 h開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,可見(jiàn)這2株的適應(yīng)能力均較強(qiáng),但后者的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期較短,培養(yǎng)9 h已進(jìn)入穩(wěn)定期;而HNSQSY14和HNSQSY31在培養(yǎng)8 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng),14 h后進(jìn)入穩(wěn)定期,約31 h后,4株菌株可能因產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物或營(yíng)養(yǎng)匱乏開始進(jìn)入衰亡期。

　　根據(jù)菌株的菌落特征,革蘭氏染色、芽孢染色和菌體形態(tài)、大小特征,根據(jù)參考文獻(xiàn)[12,13]進(jìn)行鑒定,HNSQSY04符合芽孢桿菌屬特征,HNSQSY14、HNSQSY24和HNSQSY31均有桿菌的特征。

　　3小結(jié)與討論

　　1)以山藥為材料,在從山藥中分離出的34株菌株中發(fā)現(xiàn)有4株對(duì)枯草芽孢桿菌有抑菌作用,占總菌數(shù)的11.76%,抑菌率均在24%以上,其中菌株 HNSQSY04對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果最為明顯,抑菌率達(dá)52%。而對(duì)大腸桿菌僅有1株有抑制作用。說(shuō)明來(lái)自同一種宿主的內(nèi)生菌對(duì)不同病原菌有不同的抑菌活性。但是內(nèi)生菌在活體上對(duì)病原菌的抑制能力是否和體外一致,還需進(jìn)一步的驗(yàn)證。

　　2)植物內(nèi)生菌與寄主植物經(jīng)長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化,形成互相依賴、和諧共處的關(guān)系,寄主植物為內(nèi)生菌提供生境和生長(zhǎng)發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng),植物體內(nèi)有些內(nèi)生菌對(duì)病原物具有拮抗作用或誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生抗性,從而提高寄主植物的抗病性[14],能控制作物病害的內(nèi)生菌是一種潛在而豐富的生防資源。內(nèi)生菌在植物體內(nèi)長(zhǎng)期進(jìn)化,可能擁有部分與宿主相同的基因,也可產(chǎn)生與宿主相同或相似的活性成分[15],宿主可為進(jìn)行內(nèi)生菌代謝產(chǎn)生活性成分的機(jī)理研究提供材料。

　　3)本試驗(yàn)從鐵棍山藥和惠樓山藥中分離得到的內(nèi)生菌株都屬于桿菌,但具體的種屬劃分還需對(duì)內(nèi)生菌進(jìn)行生化試驗(yàn)、16S rDNA序列測(cè)定等進(jìn)一步研究。這些菌株能否增加山藥的抗病性,能否對(duì)除試驗(yàn)所用病原菌以外的病原菌有抑菌作用,還需進(jìn)一步研究。

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