目的：探討多沙唑嗪對兔腹主動脈球囊損傷后血管狹窄的影響，及其與血清一氧化氮、血管內膜中膜平滑肌細胞增生的關系。
　　方法：23只新西蘭兔隨機分為3組，其中正常對照組5只，球囊損傷組9只，多沙唑嗪組9只。正常對照組用普通飼料喂養，不予任何方式處理。另兩組行腹主動脈球囊損傷術，同時多沙唑嗪組應用多沙唑嗪控釋片4mg/d，術后4周處死兔，觀察各組血清一氧化氮差異，以及血管損傷處血管內膜、中膜、外膜厚度、新生內膜面積、管腔面積、內彈力層及外彈力層包圍面積、血管內膜中膜增殖細胞核抗原（PCNA）免疫組化陽性平均灰度的變化情況。
　　結果：球囊損傷成功造成兔血管狹窄模型。手術開始時多沙唑嗪組和球囊損傷組兩組血清一氧化氮水平無差異(p＞0.05)，手術4周后多沙唑嗪組血清一氧化氮含量較球囊損傷組增高（p<0.001）。多沙唑嗪組與球囊損傷組血管損傷處相比血管內膜、外膜增生減輕（p<0.05），新生內膜面積減少（p<0.001），管腔面積增加（p<0.001），內彈力層和外彈力層包圍面積增加（p<0.001），血管內膜中膜PCNA陽性平均灰度降低（p<0.001）。
　　結論：多沙唑嗪可以抑制球囊損傷后兔腹主動脈血管的狹窄，可以抑制血管內膜中膜平滑肌細胞增殖，可以增加血清一氧化氮含量。這可能有助于減輕或預防PCI術后再狹窄，為臨床藥物預防PCI術后再狹窄開辟一種新的治療途徑。
　　關鍵詞：狹窄，多沙唑嗪控釋片，一氧化氮，血管平滑肌細胞
　　
　　前言
　　PTCA術后6個月高達30－40％的再狹窄率【1】成為其廣泛應用和發展的主要障礙。研究表明血管內皮細胞的損傷是再狹窄的啟動因素，血管平滑肌細胞增殖是決定再狹窄的關鍵因素，血管重構參與再狹窄的形成【2】。多沙唑嗪是美國Pfizer公司從1978年最早研究開發的一種長效選擇性α1交感神經腎上腺素能受體阻滯劑,被廣泛用于治療高血壓和前列腺肥大并取得了良好的效果。研究表明多沙唑嗪可以抑制前列腺平滑肌細胞的增殖和促進平滑肌細胞的凋亡，并且抑制細胞外基質的合成【3】。這一作用是否能出現在心血管系統尚不明確，曾有研究提示多沙唑嗪可能具有降低PTCA后血管再狹窄的作用【4】。本研究試圖探討多沙唑嗪對血管再狹窄的影響及機制。觀察其能否減輕血管損傷后狹窄的程度，并試圖探索其機制，為以后臨床防治再狹窄提供理論依據。
　　材料和方法
　　1材料
　　健康純種新西蘭兔23只，體重2.0-2.5kg，由昆明醫學院動物科提供。隨機分為3組，正常對照組5只，球囊損傷組9只，多沙唑嗪組9只。三組性別、體重無差異。
　　2方法
　　2.1動物血管球囊損傷后狹窄模型的建立
　　用氯氨酮注射液（25mg/kg）和氯丙嗪注射液（12.5mg/kg）肌肉注射麻醉兔，固定于手術臺上。取右股動脈區為手術區，75％酒精消毒，沿股動脈方向作一縱切口，逆行鈍性分離并游離股動脈。在股動脈上剪一切口，放置5F動脈鞘，經動脈鞘將3.5×23mm球囊送入20cm至腹主動脈膈下處，用壓力泵以8個大氣壓充盈球囊，回抽球囊，直至有阻力為止，表明球囊已到腹主動脈與髂動脈分叉處，釋放球囊內壓力，1分鐘后，重復送入球囊至20cm標記處，再次擴張，如此反復抽拉3次，每次30秒，間隔1分鐘，術后即刻通過耳緣靜脈注射肝素鈉5000u并注射慶大霉素8萬u預防感染。局部縫合包扎。術后繼續1％膽固醇高脂飼料喂養4周，多沙唑嗪組給予多沙唑嗪控釋片4mg/d灌胃，4周后經耳緣靜脈注入50ml空氣處死兔。迅速取出腹主動脈，放入4%多聚甲醛中固定，待做病理切片及PCNA分析用。
　　2.2組織形態學觀察及計算機圖像分析
　　取球囊損傷部位的腹主動脈,每段長4-6mm,置于4%多聚甲醛溶液中固定24小時,不同濃度酒精逐級脫水,石蠟包埋,連續切片5張(片厚5μm),行H-E染色,中性樹膠封片,在光學顯微鏡下觀察血管壁厚度、管腔大小及內膜增生情況。利用Hias-1000計算機圖像分析系統分別測出血管內膜、中膜、外膜厚度、新生內膜面積、管腔面積、內彈力層和外彈力層包圍面積。
　　2.3免疫組化標記增殖細胞
　　組織切片于6ml/l過氧化氫液中孵育30分鐘，PBS液洗浴，室溫下與單克隆抗體孵育60min。使用兔PC-10單抗標記增殖細胞核抗原(proliferationcellnucleiantigen,PCNA),PBS液洗浴后，室溫下與生物素標記的二抗孵育60分鐘，DAB染色，蘇木精復染。各組免疫組化切片應用Hias-1000圖像分析系統對血管內膜中膜陽性反應產物進行半定量檢測分析。PCNA陽性表達為細胞核呈棕黃色。每張切片隨機選取3個視野，在400倍放大下，測量血管內膜中膜免疫組化染色灰度值，然后取其平均值。灰度值從0到255共分為256個等級，灰度值越大表示免疫組化染色越深，平滑肌細胞增殖越明顯。
　　2.4血清一氧化氮檢查
　　正常對照組于實驗開始時經耳緣靜脈抽血5ml，測定血清一氧化氮（NO）作為正常對照，另外兩組分別于高脂飼料喂養5天時和實驗結束時經耳緣靜脈抽血5ml測定NO。血清NO測定采用硝酸還原酶法，應用一氧化氮試劑測定盒。
　　2.5統計學處理
　　使用SPSS11.5統計軟件包。計量資料數據用均數±標準差表示，組內比較使用配對t檢驗，組間比較使用單因素方差分析。以P<0.05為結果有統計學意義。
　　結果
　　1.三組血管形態學變化
　　正常對照組血管內皮細胞正常、內彈力板完整，內膜面積為零。球囊損傷組血管內膜有程度不等的增厚，主要由平滑肌細胞、散在的炎性細胞組成，細胞外基質有大量不定形物質沉積，內彈力板分離斷裂，中膜平滑肌增生，管腔明顯狹窄。多沙唑嗪組血管內膜稍有增厚，較球囊損傷組明顯減輕，平滑肌細胞增生不明顯，管腔狹窄不明顯。
　　表1.三組血管內膜、中膜、外膜厚度（單位：um）
　　組別 外膜厚度 中膜厚度 內膜厚度
　　正常對照組 210±32 233±24 10±7
　　球囊損傷組 587±33 223±36 920±57
　　多沙唑嗪組 368±58 228±25 30±6
　　如表1所示，球囊損傷組、多沙唑嗪組損傷部位血管內膜、外膜均較正常對照組增厚(P<0.001)，但是多沙唑嗪組其損傷部位血管內膜、外膜厚度均較球囊損傷組減低（P<0.01）。而中膜三組無顯著性差異（p>0.05）。
　　表2.三組血管動脈管腔面積、新生內膜面積比較（單位：um2）
　　組別 管腔面積 新生內膜面積
　　正常對照組 3720±40 0
　　球囊損傷組 1370±28 1213±260
　　多沙唑嗪組 3430±15 82±12
　　本研究還觀察到多沙唑嗪組、球囊損傷組血管管腔面積減小（與正常對照組相比，p<0.05），新生內膜面積明顯增加（與正常對照組相比，p<0.001），但是多沙唑嗪組血管管腔面積較球囊損傷組明顯增大（p<0.001），新生內膜面積明顯減小（p<0.001）。（見表2）。
　　表3.三組血管動脈內彈力層和外彈力層包圍面積（單位：um2）
　　組別 內彈力層包圍面積（um2） 外彈力層包圍面積（um2）
　　正常對照組 3800±412 4900±159
　　球囊損傷組 2595±232 3866±245
　　多沙唑嗪組 3466±143 4548±231
　　此外雖然多沙唑嗪組和球囊損傷組內彈力層包圍面積和外彈力層包圍面積減小（與正常對照組相比，p<0.01），但是多沙唑嗪組內彈力層包圍面積和外彈
　　力層包圍面積均較球囊損傷組有顯著性增加（p<0.05）。（見表3）。
　　2三組血清NO結果
　　正常對照組血清NO含量為93.72±7.71umol/l，與試劑盒所提供的兔血清NO含量相符。球囊損傷組術前血清NO含量為94.58±18.0umol/l，多沙唑嗪組術前血清NO為89.94±18.01umol/l，三組間無顯著性差異（p>0.05）。球囊損傷組術后4周時血清NO含量為21.63±13.56umol/l，與球囊損傷組術前比較明顯降低（p<0.001）。多沙唑嗪組術后4周時血清NO含量為62.57±17.33umol/l，與多沙唑嗪組術前相比明顯降低（p<0.001）。但是多沙唑嗪組術后4周時血清NO明顯比球囊損傷組術后4周時增加（p<0.05）。
　　3三組PCNA免疫組化陽性結果
　　正常對照組血管內膜中膜PCNA陽性平均灰度為3.4±0.9。球囊損傷組血管內膜中膜可見大量平滑肌細胞增生，PCNA陽性平均灰度為112.8±23.4（與正常對照組比較，p<0.001）。多沙唑嗪組血管內膜中膜PCNA陽性平均灰度9.5±1.3（與正常對照組比較，p<0.05）。多沙唑嗪組血管內膜中膜PCNA陽性平均灰度與球囊損傷組相比明顯低（p<0.001）。
　　討論
　　PTCA術后再狹窄是動脈損傷后血管過度修復反應的表現，不僅涉及血管內膜和中膜，血管外膜在損傷修復過程中也有作用，可能參與再狹窄的形成。再狹窄的血管重塑機制是一個復雜的過程，大致由血管彈性回縮、血栓形成、生物活性因子的釋放、VSMC增殖遷移、新生內膜形成、內皮修復、細胞外基質的形成及血管重塑等環節構成。血管重塑是血管壁為適應血管腔內血流動力學環境變化而產生的病理生理現象，包括適應性血管重塑和病理性血管重塑，其機制尚不明確。
　　本研究采取球囊血管內膜剝脫法復制血管再狹窄模型，此種方法造成血管的內膜增生與人類PTCA術后再狹窄的病理過程相似【5】。雖然不能模仿人體冠脈狹窄PTCA術后再狹窄的全部病理生理過程，但著眼于其中最重要的血管平滑肌細胞增殖和血管重塑環節并給予處理，希望從中得到啟示。本研究發現應用多沙唑嗪控釋片4mg/d治療4周能明顯抑制兔損傷處動脈內膜、外膜的增生，并明顯增加血管管腔面積，增加血管內彈力層包圍面積和外彈力層包圍面積。這表明多沙唑嗪控釋片能減輕球囊損傷后的血管狹窄，并對血管重塑產生正性調節作用。與Vashisht等【6】對兔的腹主動脈內膜剝脫術后應用多沙唑嗪治療后發現內膜增生明顯被抑制，而且呈劑量依賴性的研究相一致。
　　VSMC的增殖和遷移是血管內膜增生的關鍵環節，而抑制VSMC的增殖和遷移，則是阻止血管狹窄性疾病的一個重要方面。PCNA位于細胞核內，且僅在S期出現，S期結束時又消失，所以又稱細胞周期蛋白，是S期的特異性標記，被作為SMC增殖的指標。本研究發現，多沙唑嗪組損傷動脈內膜中膜PCNA染色陽性顆粒明顯少于球囊損傷組，說明多沙唑嗪明顯抑制了損傷動脈處的VSMC增殖。
　　研究表明多沙唑嗪可以通過抑制ａ1腎上腺素能受體而抑制VSMC增殖。此外多沙唑嗪能通過與ａ1受體拮抗無關的機制抑制VSMC多條有絲分裂信號途徑。Ulrich等已經證明，多沙唑嗪可以通過增加細胞周期依賴性激酶抑劑P27的表達，抑制Rb的磷酸化，使VSMC的有絲分裂停止在G1期，從而抑制細胞的增殖。KintscherU等【7】也發現多沙唑嗪可抑制人冠脈VSMC從G1期至S期的轉換，這種作用與多沙唑嗪阻止Rb的磷酸化有關，進一步研究發現多沙唑嗪能抑制血清引起的P27蛋白降解，使VSMC中P27蛋白始終處于較高水平，即阻止P27下調而增加P27的表達。P27屬于細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑家族，主要通過抑制G1-S限制點中的各種周期蛋白及周期蛋白依賴性激酶而使細胞停滯于G0/G1期。
　　NO主要由內皮細胞和VSMC分泌，由左旋-精氨酸經一氧化氮合成酶（NOS）的作用而生成。具有舒張血管、抑制VSMC增殖的作用。有關多沙唑嗪對NO影響的研究尚不多見。國外有研究報道【8】多沙唑嗪在降壓過程中可以增強腎臟組織切片中的NOS活性，增加NO的產生。國內楊君等【9】研究發現高血壓患者的腸系膜動脈VSMC具有分泌NO的功能，服用多沙唑嗪的患者其腸系膜動脈VSMC分泌的NO明顯增加。本研究發現球囊損傷血管內膜后血清NO濃度明顯降低，應用多沙唑嗪4周可使兔血清NO含量明顯上升。結果與國內、外的相關報道相符。NO對再狹窄有防治作用，主要通過抑制VSMC增殖、抑制血小板粘附和聚集、抑制白細胞粘附、影響血管重塑等機制發揮作用【10】。有研究發現NO是通過上調p27和p21,延長細胞周期而抑制VSMC增生的【11】。NO通過使p27和p21的表達上調，抑制Rb蛋白磷酸化，使VSMC停滯在G0期，細胞周期在G1期受阻,SMC增殖受抑。本研究亦發現多沙唑嗪能夠增加血清NO含量，并表現為減輕血管狹窄，這是否為多沙唑嗪通過增加血清NO含量，上調p27和p21表達，抑制VSMC增殖，從而達到減輕血管狹窄的結果還有待于進一步研究。
　　參考文獻：
　　【1】PopmaJJ，CalifRM，TopolEL．Clinicaltrialsofrestenosisaftercoronaryangioplasty[J]．Circulation．1991；84(3)：1426-1436．
　　【2】SchieleTM，KrotzF，KlaussV。Vascularrestenosis-strivingfortherapy.Expert-Opin-Pharmacother[J].2004，5(11):2221-2232
　　【3】RoehrbornCG，SchwinnDA。Alpha1-adrenergicreceptorsandtheirinhibitorsinlowerurinarytractsymptomsandbenignprostatichyperplasia[J].J-Urol.2004Mar;171(3):1029-1035
　　【4】楊君，秦永文，趙霞.多沙唑嗪對PTCA術后再狹窄的防治作用機制.實用醫藥雜志[J].2002；19（9）：711-712.
　　【5】候英萍，喬宏慶.血管再狹窄的動物模型與放射性治療[J].心臟雜志.2000，12（1）：43-44.
　　【6】VashishtR，SianM，franksPJ，etal．Long-termreductionofintimalhyperplasiabytheselectivealpha-1adrenergicantagonistdoxazosin[J]．BrJSurg．1992；79(11)：1285-1288．
　　【7】KintscherU，WakinoS，KimS，etal．DoxazosininhibitsretinoblastomaproteinphosphorylationandG(1)-->Stransitioninhumancoronarysmoothmusclecells[J]．ArteriosclerThrombVascBiol．2000；20(5)：1216-1224．
　　【8】TojoA，KobayashiN，KimuraK，etal．Effectsofantihypertensivedrugsonnitricoxidesynthaseactivityinratkidney[J]．KidneyIntSuppl．1996；55（６）：S138-１40
　　【9】楊君，秦永文．多沙唑嗪對高血壓患者動脈血管平滑肌細胞NO產生的影響[J]．山東醫藥．2001；41（22）：15－16．
　　【10】LeeJS，AdrieC，JacobHJ，etal．Chronicinhalationofnitricoxideinhibitsneointimalformationafterballoon-inducedarterialinjury[J]．CircRes．1996；78(2)：337-342．
　　【11】SatoJ，NairK，HiddingaJ，etal．eNOSgenetransfertovascularsmoothmusclecellsinhibitscellproliferationviaupregulationofp27andp21andnotapoptosis[J]．CardiovascRes．2000；47(4)：697-706．