自1981年在美國被發(fā)現(xiàn)以來，艾滋病(AIDS)就呈不斷蔓延的趨勢[1]。2017年全球共報告新發(fā)HIV感染180萬(140萬～240萬)，HIV感染者達3690萬人(3110萬～4390萬)[2]。2017年(2017年1月1日零時至12月31日24時)全國(不含港澳臺)共報告法定傳染病發(fā)病7030879例，死亡19796人，其中艾滋病死亡15251例(77.04%)[3]。目前艾滋病尚未有根治的方法和有效的疫苗，因此艾滋病的防治工作主要是控制艾滋病的傳播，以預(yù)防為主，普及艾滋病的檢測，盡早地發(fā)現(xiàn)感染者[4]。而HIV實驗室檢測技術(shù)則是開展艾滋病各項預(yù)防、治療以及干預(yù)措施的基本手段之一。HIV的實驗室檢測主要包括血清學(xué)檢測、淋巴細胞檢測和核酸檢測[5]。血清學(xué)檢測一般用于艾滋病常規(guī)篩查和確證實驗，檢測血清中HIV抗原或(和)抗體，易于自動化且成本較低[6]，但是不能應(yīng)用于HIV感染者的治療及用藥監(jiān)測。淋巴細胞檢測主要用于了解機體的免疫狀態(tài)、確定用藥治療時機及疾病分期、判斷治療效果和臨床并發(fā)癥等[7]，但是這種方法的特異性較低，僅作為艾滋病患者確證后的檢測手段，不能用于艾滋病的早期診斷。而核酸檢測由于靈敏度和特異性高，窗口期短[8](HIV感染者血漿中HIVRNA出現(xiàn)時間早，病毒感染后約10天，在血漿中病毒載量即達到核酸擴增技術(shù)可檢測出的水平)，因此可以用于艾滋病的早期診斷，并且其在臨床治療效果、耐藥性的監(jiān)測及病程的監(jiān)控、預(yù)測等方面均有廣泛的應(yīng)用[9]。根據(jù)不同的應(yīng)用場景，HIV核酸檢測可以分為：大型醫(yī)院、基層衛(wèi)生服務(wù)機構(gòu)(社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心、鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院等)以及家庭檢測。

　　1大型醫(yī)院的HIV核酸檢測

　　目前臨床上很多大型醫(yī)院如三級醫(yī)院等都有分子生物學(xué)實驗室，能夠滿足HIV核酸檢測的環(huán)境及人員要求。在大型醫(yī)院，HIV的核酸檢測主要依賴于自動化或半自動化的大型儀器，能夠?qū)崿F(xiàn)較高通量的核酸檢測，滿足大樣本量的需求，可分為定性和定量檢測。截至目前，通過我國藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械注冊且仍在有效期內(nèi)的HIV核酸檢測試劑有11種(表1)，其中進口產(chǎn)品3項，國產(chǎn)8項。定性檢測主要用于艾滋病的早期診斷，常用的檢測試劑盒有歐盟批準生產(chǎn)的AbbottM2000HIV-1RNA/DNA定性檢測試劑，使用Taqman探針法進行檢測;美國食品與藥品監(jiān)督管理局(FoodandDrugAdministration，F(xiàn)DA)批準的Gen-Probe公司生產(chǎn)的AptimaHIV-1RNA核酸定性檢測試劑在臨床中也有應(yīng)用[10]，其檢測原理為轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的等溫擴增系統(tǒng)(transcriptionmediatedamplification，TMA)結(jié)合化學(xué)發(fā)光標記的探針雜交檢測，檢測的靶基因為HIV-1LTR和多聚酶基因。定量檢測可用于艾滋病的早期診斷、監(jiān)測抗病毒治療效果及疾病進展。臨床上常用的定量檢測試劑包括美國羅氏分子診斷公司研發(fā)的RocheCobasTaqManv2.0和美國AbbottMolecular公司生產(chǎn)的AbbottRealTimeHIV-1檢測試劑盒。其技術(shù)主要基于實時熒光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR)的方法對血清中HIV核糖核酸/脫氧核糖核酸(RNA/DNA)進行定量分析，上述兩種試劑盒主要應(yīng)用了Taqman水解探針法，自1996年美國PerkinElmer公司發(fā)明TaqMan技術(shù)以來[11]，該技術(shù)如今已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到HIV基因檢測[12]。法國Biomerieux公司生產(chǎn)的NucliSENSEasyQHIV-1v2.0應(yīng)用了分子信標技術(shù)，這種基于非水解探針的分子信標技術(shù)也是較常用的一種核酸檢測方法，在檢測HIV-1病毒載量時與TaqMan探針法具有較好的相關(guān)性和一致性[13-14]，但分子信標探針設(shè)計較為復(fù)雜且成本較高。實時熒光定量PCR技術(shù)與常規(guī)的PCR技術(shù)相比[15]，特異性更高，不僅能夠有效地解決PCR過程的污染問題，而且具有自動化程度高等特點。目前實時熒光定量PCR在市場上應(yīng)用廣泛，我國常用國內(nèi)外的實時熒光定量PCR試劑進行檢測。深圳凱杰公司、廣州達安公司等均已研發(fā)出HIV核酸診斷試劑投入市場[16]。美國SiemensHealthcareDiagnostics公司基于分支鏈DNA信號放大技術(shù)(branchedDNA，bDNA)研發(fā)了VER-SANTHIV-1RNAbDNA3.0檢測試劑盒。bDNA技術(shù)于1989年由美國Chiron公司研發(fā)[17]，基于特殊的分支鏈信號放大系統(tǒng)，靶標被捕獲探針捕獲后，與各級探針雜交，最后用與bDNA放大序列互補的堿性磷酸酶(AP)標記的寡核苷酸通過雜交與bDNA分子結(jié)合。通過對化學(xué)發(fā)光的強度的測定對靶標進行定量檢測[18]。由于反應(yīng)過程不依賴于核酸擴增，因此不存在擴增產(chǎn)物的污染問題，這是該技術(shù)的一大優(yōu)勢，但如何提高檢測的靈敏度是該技術(shù)的難點。同時該技術(shù)的缺陷在于信號放大探針在制備上難度較大且操作步驟過于繁瑣，限制了其在臨床檢測中的應(yīng)用。上述試劑所需的配套儀器成本高、體積大，對操作人員的專業(yè)要求較高，適用于樣本量較大的大型中心醫(yī)院的檢測。根據(jù)國內(nèi)外的相關(guān)數(shù)據(jù)及文獻報道，考慮到HIV檢測的特殊性，避免誤診，《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范(2015年修訂版)》中建議用5000拷貝/mL作為判斷結(jié)果的閾值，兩次定量檢測更有助于準確判斷結(jié)果[19]。對于評估抗病毒藥物療效和病程進展，同一病人宜使用相同試劑，有助于合理解讀病毒載量的變化。

　　2基層衛(wèi)生服務(wù)機構(gòu)的HIV核酸檢測

　　由于艾滋病復(fù)雜的病程及其難治性，艾滋病患者到大醫(yī)院診治的時間相對來說較為短暫，其大部分的時間是在家庭、社區(qū)中度過的，HIV的檢測也應(yīng)當盡可能地拓展到整個社會中去，以基層衛(wèi)生服務(wù)機構(gòu)為核心開展HIV感染者的社區(qū)檢測，已成為迫在眉睫的社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)任務(wù)[20]。基層醫(yī)療衛(wèi)生服務(wù)機構(gòu)由于經(jīng)費投入不足、醫(yī)務(wù)人員水平有限，適合使用價格低廉、操作簡便的一體化檢測設(shè)備，從而降低核酸檢測對實驗室及操作人員的要求。設(shè)備的各個樣本檢測模塊相互獨立，可以實現(xiàn)樣本的即到即檢。《“十三五”深化醫(yī)藥衛(wèi)生體制改革規(guī)劃》中強調(diào)建立科學(xué)合理的分級診療制度，提升基層醫(yī)療衛(wèi)生服務(wù)能力[21]。就HIV檢測而言，社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心等基層醫(yī)療機構(gòu)由于存在場地及人員限制，大多不能進行常規(guī)的核酸檢測，而近年來全自動及集成化的HIV核酸即時檢測(pointofcaretesting，POCT)設(shè)備的發(fā)展，使得社區(qū)醫(yī)院及資源匱乏地區(qū)的HIV核酸檢測成為可能。傳統(tǒng)的PCR實驗一般都要進行樣本的裂解、核酸提取、純化及濃縮等繁雜的樣品制備過程，耗費時間久[22]。近幾年市場上興起的微流控芯片技術(shù)為實現(xiàn)HIV核酸的即時檢測提供了很好的發(fā)展方向。微流控芯片又稱芯片實驗室(Labonachip，LOC)[23]，是指在幾平方厘米大小的芯片上構(gòu)建生物或化學(xué)實驗室。微流控技術(shù)具有所需樣品體積小、檢測效率高、使用成本低且具有良好的兼容性、有望實現(xiàn)便攜式檢測裝置等特點[24-25]。美國Cepheid公司開發(fā)了一款從樣品中核酸的提取到完成PCR檢測完全實現(xiàn)自動化的GeneXpert微流控核酸檢測系統(tǒng)，反應(yīng)中大多數(shù)液體是以凍干的形式預(yù)先填充的，大大減少了樣品混淆和操作錯誤的機會。從樣本的制備到完成測試出檢測結(jié)果僅需要半小時，減輕了操作者的工作強度。其研發(fā)的HIV定性檢測試劑靶基因為HIV-1LTR區(qū)，可以對患者全血或者干血斑進行檢測，其檢測結(jié)果與AbbottM2000HIV-1realtime檢測試劑盒有較好的一致性[26]。Abbott公司的AlereqHIV檢測平臺只需要25uL外周血或血漿1h內(nèi)完成多重實時PCR反應(yīng)來檢測HIV-1(M/N)亞型，HIV-1(O)亞型和HIV-2型病毒。羅氏公司生產(chǎn)的CobasLiat使用微流控芯片技術(shù)，通過擠壓PCR反應(yīng)試劑在三個擁有不同溫區(qū)的腔室內(nèi)來回移動來實現(xiàn)PCR反應(yīng)所需要的溫度循環(huán)，這種以空間上的溫度循環(huán)來取代時間上的溫度循環(huán)的方式極大了縮減了PCR所需的反應(yīng)時間，可應(yīng)用于艾滋病的快速檢測，但空間域PCR需要更多樣化的以及更大的微流控平臺[27]。另外，2014年劍橋大學(xué)研發(fā)的全自動SAMBA檢測平臺[28-29]可用于全血或血漿樣本的HIV核酸的快速檢測，其基于等溫擴增的原理，與AbbottRealTimeHIV-1檢測試劑盒的檢測一致性可達98%[30]。上述幾種可用于HIV即時檢測的微流控核酸檢測設(shè)備產(chǎn)品比較情況，詳見表2。這幾種HIV微流控核酸檢測可以解決基層衛(wèi)生服務(wù)機構(gòu)或資源匱乏地區(qū)的HIV現(xiàn)場檢測環(huán)境及人員限制的問題，使基層醫(yī)療單位具備開展核酸檢測的能力。但是其儀器與試劑成本均較高(以GeneXpert為例，一臺儀器價格約在90萬～120萬左右)，且產(chǎn)品缺乏市場規(guī)范和標準，因此目前沒有大范圍推廣.

　　3家庭檢測

　　HIV家庭檢測的私密性高，產(chǎn)品便攜且便于使用，在說明書的指導(dǎo)下即可完成操作，采樣過程簡單，檢測過程需要很少或不需要試劑、設(shè)備，結(jié)果判讀簡單，將是未來HIV檢測主要的發(fā)展方向之一。紙條檢測是最易于家庭使用的檢測方式，HIV抗原抗體檢測膠體金法已廣泛應(yīng)用于艾滋病篩查實驗[31]，但是市場上HIV核酸檢測紙條檢測的相關(guān)應(yīng)用較少。2012年，美國休斯敦萊斯大學(xué)的RebeccaR.Richards-Kortum團隊描述了一種紙條測定方法，該方法使用金納米顆粒探針和金增強溶液定量檢測擴增的HIVRNA[32]，檢測時間只需20分鐘，每個試劑盒成本約為0.80美元。核酸紙條檢測在HIV即時檢測方面有巨大的潛力，其優(yōu)勢在于制備簡單、成本低廉、操作易行、對環(huán)境友好，檢測時間短及結(jié)果可視化等，但在靈敏度方面還有很大的提高空間。由于分析物通過紙條傳送，局部分析物濃度可能因溶液擴散而減少，而在多重檢測中有些信號分子可能會擴散到鄰近通道[33]，因此還存在交叉污染的可能性，且目前核酸紙條的制備方法仍不成熟，這些因素限制了HIV核酸紙條檢測在市場的應(yīng)用。

　　4小結(jié)與展望

　　艾滋病的早發(fā)現(xiàn)早治療依賴于HIV實驗室檢測技術(shù)，而在眾多實驗室檢測方法中HIV核酸檢測窗口期短，靈敏度高，對艾滋病的早期診斷、病程檢測、抗病毒治療效果評價和耐藥性檢測等非常重要，但由于HIV基因存在多樣性，且高度變異，很難設(shè)計一套引物能夠覆蓋所有的HIV序列，因此檢測的靈敏度受到限制[34]，現(xiàn)有的HIV檢測方法或是操作復(fù)雜、對實驗人員要求較高或是儀器及試劑較為昂貴，檢測成本較高，既難以在一般的PCR實驗室推廣，也不適合對大量病人的現(xiàn)場快速檢測，難以實現(xiàn)廣泛的臨床應(yīng)用。通過對當前HIV核酸檢測的現(xiàn)狀分析可以發(fā)現(xiàn)，未來HIV核酸檢測的發(fā)展目標是進一步縮短檢測窗口期，提高檢測靈敏度、特異性，降低漏檢率，開發(fā)出檢測速度快，操作簡單方便的檢測方法、試劑或儀器，且能夠降低檢測成本，使其能夠滿足基層醫(yī)療單位及欠發(fā)達地區(qū)艾滋病檢測實際工作的需要。微流控芯片技術(shù)能將樣本制備、核酸提取、擴增和檢測各個部分進行整合，自動化操作完成全過程，具有液體流動可控、試劑消耗量小和分析速度快的特點[35-36]，將在未來HIV核酸檢測中發(fā)揮重要的作用。

　　《HIV核酸檢測技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀》來源：《中國艾滋病性病》，作者：張雅 卓之豪 張師音