摘　要:目的　探索一種簡單、方便、有效的彎曲菌菌種保存方法。方法　采用含30 %甘油的腦心浸液肉湯,將實驗室保存的19 株彎曲菌于- 30 ℃和- 70 ℃分別保存,每個菌株3 個菌種管。1 年后,采用5 %脫纖維羊血的布氏肉湯進行增菌,然后轉種哥倫比亞血平板,比較存活效果。結果　- 30 ℃條件下采用多管法保存彎曲菌可以獲得與- 70 ℃條件下保存相當的效果。結論　采用多管法(每株菌3個菌種管) 于- 30 ℃冷凍保存彎曲菌是一個簡單、方便、有效、實用的方法。

　　關鍵詞:彎曲桿菌屬保存,生物學低溫保存

　　彎曲菌是一類對生長條件要求非常苛刻的細菌,需要在微需氧的環境下(約10 % CO2 , 5 % O2 ) 才能良好地生長。彎曲菌也是一類保存比較困難的細菌,用一般的方法保存有一定的困難,在實際菌種保藏工作中如操作不當極易造成菌種的死亡。有效的保存分離菌株是對彎曲菌進行研究的基礎。在過去的研究中,采用的保存方法種類比較多,文獻[1 ,2]采用真空冷凍干燥技術進行保存菌種,在FDA 的方法[3] 中,介紹冷凍培養基- 70 ℃冷凍保存以及半固體保存方法,在國標[4] 中短期采用4 ℃冰箱微需氧保存,長期保存用凍干法。在上述方法中最穩定有效的方法是真空冷凍干燥技術,但是該方法較為復雜,還需要冷凍干燥設備。而半固體和新鮮菌落于微需氧條件下保存的時間比較短。- 70 ℃冷凍保存方法相對簡單,但是- 70 ℃冰箱價格昂貴,基層單位比較少。在對菌種的復蘇方法中,有的直接將菌種涂布平板微需氧培養[1 ] ,有的將菌種加入增菌液中進行增菌后再涂布血平板[3 ] ,復蘇方法的差異會嚴重影響菌種保存的效果。為探索一套方便有效的彎曲菌菌種保存及復蘇方法,本實驗室用30 %的甘油腦心浸液肉湯,分別在- 30 ℃及- 70 ℃對彎曲菌菌種進行多管(每個菌種3 個管) 冷凍保藏,復蘇時用不加抗生素的布氏肉湯,于微需氧條件復蘇培養24 h ,轉種哥倫比亞血平板微需氧條件培養48 h。實驗的菌株為2004 年及2005 年分離到的彎曲菌共19 株,其中包括空腸彎曲菌、結腸彎曲菌和紅嘴鷗彎曲菌。

　　1 　材料及方法

　　111 　培養基　哥倫比亞血瓊脂　哥倫比亞基礎培養基(OXOID) ,按照培養基配置的說明進行配置并進行高壓滅菌,將培養基保溫到45 ℃,然后加入5 %的脫纖維羊血制血平板。腦心浸液肉湯　腦心浸液干粉培養基(北京陸橋技術有限責任公司) 按照培養基的配置說明操作,高壓滅菌。布氏肉湯2 號營養肉湯(OXOID ,Basing Stoke ,Hampshire ,England) 按照培養基說明進行配制,高壓滅菌,加入5 %脫纖維羊血。

　　112 　菌株　2004 年及2005 年北京市疾病預防控制中心營養與食品衛生所微生物實驗室從市場銷售的禽肉中分離到的彎曲菌屬菌株19 株,其中包括空腸彎曲菌、結腸彎曲菌和紅嘴鷗彎曲菌。

　　113 　低溫冰箱　- 30 ℃低溫冰箱(SANYO ,MedicalFreezer) 、- 70 ℃冰箱(SANYO ultra2low freezer) ,塑料菌種管(118 ml 冷凍管、彩蓋硅膠墊圈) (上海嘉迪塑料制品有限公司) 。

　　114 　方法

　　11411 　菌種制備　將彎曲菌菌種劃線接種于哥倫比亞血瓊脂平板, 42 ℃微需氧條件下培養48 h ,獲得活力旺盛的菌體。菌種保存　按照體積比將腦心浸液肉湯加入

　　30 %的滅菌甘油,分裝到塑料菌種保存管中備用,也可以將其冷凍保存隨用隨取。用接種環刮取哥倫比亞平皿表面的菌體,溶于腦心浸液肉湯甘油中。將菌濃度調到6 個麥氏濃度以上。將制好的腦心浸液甘油菌懸液,于- 30 ℃或- 70 ℃的冰箱中迅速冷凍。

　　11412 　菌種的復蘇　將菌種管從冰箱中取出,室溫放置呈為液態后,將整管的菌懸液加入到未加抗生素的布氏肉湯10 ml 中,在微需氧的條件下培養24h ,如菌體損傷嚴重,需要復蘇的時間較長,培養24 h菌體得不到有效的復蘇,需要再繼續培養24 h。將培養24～48 h 的增菌液劃線接種于哥倫比亞血平板,于微需氧的條件下培養48 h 得到復蘇的菌種。將本實驗室從禽類中分離到的彎曲菌19 株按上述

　　方法于2005 年4 月保存,并于2006 年4 月取出,用上述方法進行復蘇,檢驗菌種保存的效果。

　　2 　結果

　　211 　在- 70 ℃保存的菌種共19 株,采用本方法全

　　部存活。

　　212 　在- 30 ℃保存的菌種共19 株,在菌種復蘇培養過程中3 個菌種管中的彎曲菌在增菌過程中沒有復蘇成功,但由于在保存的過程中,1 個菌株保存了

　　3 管,其它菌種管保存的菌株用相同方法進行培養獲得了成功。本文采用加入30 %甘油的腦心浸出液肉湯對彎曲菌進行菌種保存,用未加抗生素的布氏肉湯進行復蘇,此方法簡單、實用、有效,不需要特殊的設備,適用于基層微生物實驗室日常彎曲菌菌株保存工作。