帕金森病（Parkinson′sdisease，PD）是一種神經系統退行性疾病，其病理特征為黑質和紋狀體多巴胺（dopamine，DA）能神經元變性缺失、紋狀體DA含量顯著減少[1]。目前臨床上常用左旋多巴類藥物治療PD，該類藥物只能改善PD的臨床癥狀，無法從根本上控制和阻斷PD的進程。并且隨著病程不斷增長和用藥量的加大，所顯現出來的副作用也越來越明顯。因此，尋找療效確切且副作用小的藥物成為研究PD藥物的熱點。

　　[摘要]目的：探討蓽茇總生物堿（PLA）對6-羥基多巴胺（6-OHDA）致帕金森病（PD）大鼠多巴胺能神經元損傷的保護作用及其可能的機制。方法：采用腦立體定位單側紋狀體注射6-OHDA建立大鼠PD模型，將PD大鼠隨機分為PLA組（PLA50mg・kg-1・d-1），美多巴組（美多巴50mg・kg-1・d-1）及模型組，每組15只，每日灌胃給藥1次，連續6周。另隨機選取15只大鼠在紋狀體僅注射生理鹽水作為假手術組。采用阿樸嗎啡（APO）誘導的大鼠旋轉及轉棒實驗進行行為學觀察，酪氨酸羥化酶（TH）免疫組化檢測大鼠黑質中TH陽性細胞數及紋狀體中TH陽性纖維密度，用分光光度法檢測大鼠黑質及紋狀體內超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、還原型谷胱甘肽（GSH）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）及一氧化氮合酶（NOS）的含量。結果：帕金森病大鼠在APO誘導后出現明顯的旋轉行為，且在轉棒上的滯留時間縮短，黑質區TH陽性細胞數及紋狀體TH陽性纖維密度明顯減少，組織內SOD，GSH-Px，CAT的活力降低，NOS的活力升高，MDA，NO含量升高，GSH含量降低，總抗氧化能力明顯降低。PLA能明顯改善PD大鼠的行為學異常，增加黑質區TH陽性細胞數及紋狀體TH陽性纖維密度，提高組織內SOD，GSH-Px，CAT的活力，降低NOS的活力，降低MDA和NO含量，提高GSH含量，總抗氧化能力明顯提高。結論：蓽茇總生物堿對6-OHDA致PD模型大鼠的黑質細胞具有保護作用，其機制可能與抗氧化活性有關。

　　[關鍵詞]浙江中醫雜志,帕金森病,蓽茇,生物堿,6-羥基多巴胺,抗氧化

　　蓽茇PiperlongumL.是中蒙藏維醫習用藥材，具有溫中散寒，行氣止痛等功效，在印度也廣泛應用[2]。蓽茇中含有較豐富的酰胺類生物堿，并且具有抗炎、抗氧化、抗乙肝病毒和免疫調節等廣泛的藥理活性[3-4]。近年來的研究表明，蓽茇中含量最高的胡椒堿具有很強的抗氧化作用，可以通過抑制線粒體膜通透性的改變減少MPP+誘導PC12細胞的凋亡[5]，并且對6-羥基多巴胺（6-OHDA）誘導的PD大鼠具有神經保護作用，推測可能是通過抗凋亡和抗炎機制發揮神經保護作用[6]。本課題組在前期研究工作中，已建立了蓽茇總生物堿（PLA）有效部位提取制備的穩定工藝[7]，并對蓽茇總生物堿的化學成分及其在大鼠體內的藥代動力學和組織分布進行了研究[8-10]，為蓽茇總生物堿的藥效研究奠定了基礎。本研究以6-OHDA單側損傷紋狀體制備PD大鼠模型，探討蓽茇總生物堿對損傷神經元的保護作用及其對氧化應激反應的影響，為開發蓽茇防治帕金森病提供初步的實驗依據。

　　1材料與方法

　　1.1試劑6-羥基多巴胺（6-OHDA，美國Sigma公司，批號MKBH3054）；阿樸嗎啡（apomorphine，APO，美國Sigma公司，批號SLBB0077V）；美多巴（上海羅氏有限公司，批號SH1001）；酪氨酸羥化酶單克隆抗體（美國Sigma公司，批號101M4796）；鼠ABC檢測試劑盒（美國Vector公司，批號172013）；濃縮型DAB試劑盒（北京中衫金橋生物技術有限公司，批號K133319D）；總蛋白定量測試盒（批號20130216），超氧化物歧化酶（SOD）測試盒（批號20130614），丙二醛（MDA）測試盒（批號20121120），還原型谷胱甘肽（GSH）測試盒（批號20130228），谷胱甘肽-過氧化物酶（GSH-Px）測試盒（批號20121122），一氧化氮（NO）測試盒（批號20130426），一氧化氮合酶（NOS）測試盒（批號20130223）均購自南京建成生物工程研究所。

　　1.2儀器Stoelting腦立體定位儀（美國Stoelting公司）；大鼠旋轉行為記錄儀（美國ColumbusInstruments公司）；大鼠疲勞轉棒儀（西班牙Panlab公司）；CM3050S冰凍切片機（德國Leica公司）；ECLIPSE80i型顯微鏡（日本Nikon公司）；SIGMA-3K15冷凍離心機（德國SIGMA公司）；SPECTRAmaxPLUS384連續光譜酶標儀（美國分子儀器公司）。

　　1.3蓽茇總生物堿的制備蓽茇藥材購于新疆維吾爾醫院藥房（批號PLL-10-09），由新疆藥物研究所劉慶華研究員鑒定為胡椒科胡椒屬植物蓽茇P.longum的未成熟的果穗。稱取干燥粉碎的蓽茇果穗3kg，加入85%乙醇15L加熱回流提取，提取液過濾后合并濾液，回收乙醇得到蓽茇提取物。蓽茇提取物溶于水后經大孔樹脂采用0%，20%，40%，60%，85%的乙醇水溶液梯度洗脫，將60%乙醇洗脫流分合并后回收乙醇，減壓干燥得到蓽茇總生物堿有效部位，紫外分光光度法測定其總生物堿質量分數為64.43%。HPLC檢測其胡椒堿、蓽茇明寧堿和二氫蓽茇明寧堿質量分數分別為50.68%，3.74%，0.62%。

　　1.4動物分組及處理雄性SD大鼠120只，SPF級，體重220～240g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK（京）2012-0001。實驗前適應性飼養7d。造模成功后隨機分為模型組、假手術組、PLA組、美多巴組，每組15只。模型篩選24h后開始灌胃給藥，PLA組給予蓽茇總生物堿50mg・kg-1・d-1，美多巴組給予美多巴50mg・kg-1・d-1，模型組、假手術組給予相同劑量的0.5%CMC-Na水溶液，連續給藥6周，每日1次。1.5PD大鼠模型的制作及篩選大鼠經10%水合氯醛（3.5mL・kg-1）腹腔注射麻醉后，顱平位固定于大鼠腦立體定位儀上，頭部備皮消毒后，切開頭部皮膚，充分暴露前囟。參照Paxinos等[11]的大鼠腦立體定位圖譜，確定左側紋狀體三坐標點[12]：一點為前囟前0.7mm，矢狀線左側旁開2.6mm，硬膜下6.0mm；一點為前囟前0.7mm，矢狀線左側旁開2.6mm，硬膜下5.5mm；另一點為前囟前0.7mm，矢狀線左側旁開2.6mm，硬膜下5.0mm處。每點用微量注射器緩慢勻速（1.0μL・min-1）注入6-OHDA（4g・L-1，用含0.02%抗壞血酸的生理鹽水配制）1.0μL，注射完畢后留針5min，然后緩慢退針，縫合切口皮膚，外涂青霉素粉劑預防感染。假手術組用上述相同方法向左側紋狀體注射同體積的含0.02%抗壞血酸的生理鹽水。術后第5周，以皮下注射0.5mg・kg-1APO誘發大鼠向健側旋轉[13]，先使大鼠適應測試環境5min，再用計算機自動測試系統記錄APO所誘發的大鼠旋轉行為，記錄開始旋轉至30min內的旋轉圈數，以向左側（損傷側）旋轉圈數與向右側（健側）旋轉圈數的差值在30min內的平均數為凈旋轉圈數，且凈旋轉圈數>80r・h-1，則視為成功模型。

　　1.6行為學檢測分別于大鼠給藥后第3周和第6周以皮下注射APO0.5mg・kg-1誘發各組大鼠向健側旋轉，記錄開始旋轉至30min內的旋轉圈數。分別于給藥后第3，6周進行大鼠轉棒行為觀察。測試前1周每天將大鼠在8r・min-1的轉速下訓練3次，每次5min，2次訓練之間間隔20min作為疲勞恢復時間。測試當天，將大鼠放在轉棒上，啟動轉棒，開始計時，大鼠為保持平衡而跟隨轉棒運動，逐漸增加轉棒轉速，觀察大鼠運動，直至大鼠從轉棒上掉落，結束計時。

　　1.7TH免疫組化染色各組大鼠麻醉后經心臟灌流固定，斷頭取腦，經冰凍切片，進行免疫組化染色（ABC法）。切片入0.3%TritonX-100透膜30min；3%H2O2封閉內源性過氧化物酶；正常羊血清封閉30min；TH一抗4℃孵育過夜；生物素標記羊抗小鼠二抗，室溫孵育2h；辣根酶標記的鏈霉卵白素，室溫孵育30min，37℃孵育30min。以上各步驟均用0.01mol・L-1PBS洗5min×3。最后用DAB顯色。常規脫水、透明、封片。每只大鼠各取紋狀體、黑質相同部位腦片3張，通過Nikon顯微鏡采集圖像，用NIS-Elements病理圖像分析系統（Ver.2.1）進行分析，根據灰度值選取TH陽性細胞和TH陽性纖維，計算黑質區域TH陽性細胞數目和紋狀體區域TH陽性纖維密度值。

　　1.8腦組織各生化指標的測定大鼠斷頭后迅速取腦組織，分離雙側紋狀體及中腦腹側組織，準確稱取質量，用0.9%的生理鹽水制成10%的組織勻漿，2500r・min-1離心取上清，分裝后置于-80℃凍存。采用生物化學法檢測SOD，CAT，GSH-Px，NOS活性以及MDA，GSH，NO含量。以上測定均嚴格按照試劑盒說明書進行測定。

　　1.9統計學處理采用SPSS19.0軟件，數據以±s表示，采用One-WayANOVA分析各組間差異，P<0.05為具有統計學意義。

　　2結果

　　2.1蓽茇總生物堿對APO誘導旋轉行為的影響術后5周，經APO誘導后，假手術組大鼠無明顯旋轉現象，模型組大鼠存在異常旋轉行為，旋轉圈數與假手術組相比明顯增多（P<0.05）。PLA組經給藥治療3周后，大鼠的旋轉圈數與模型組相比明顯減少（P<0.05），見表1。

　　2.2蓽茇總生物堿對大鼠轉棒行為的影響術后5周，假手術組大鼠在轉棒上的滯留時間為（65.0±4.1）s，模型組大鼠平衡協調運動功能較差，在轉棒上的滯留時間明顯比假手術組短（P<0.05）。PLA組經給藥治療6周后，大鼠在轉棒上的滯留時間較模型組顯著增加（P<0.05），見表2。

　　2.3蓽茇總生物堿對PD大鼠腦組織內TH表達的影響與假手術組相比，模型組黑質部位TH陽性細胞明顯減少（P<0.05），紋狀體部位的TH陽性纖維密度明顯降低（P<0.05）。經給藥6周后，PLA及美多巴組與模型組相比，黑質部位TH陽性細胞數目顯著增加（P<0.05），紋狀體部位的TH陽性纖維密度明顯升高（P<0.05），見表3。

　　2.4蓽茇總生物堿對PD大鼠腦組織內SOD，GSH-Px，CAT，NOS活性和MDA，GSH，NO含量的影響與假手術組相比，模型組大鼠損傷側紋狀體和黑質的SOD，CAT，GSH-Px活性明顯降低（P<0.05），NOS的表達增加（P<0.05），MDA和NO的含量升高（P<0.05），GSH的含量降低（P<0.05）。與模型組相比，經灌胃給藥6周后，PLA組及美多巴組上述指標均有明顯改善，大鼠黑質及紋狀體內的SOD，CAT，GSH-Px活性明顯增加（P<0.05），NOS的表達降低（P<0.05），MDA和NO的含量降低（P<0.05），GSH的含量增加（P<0.05），見表4，5。

　　3討論

　　帕金森病是一種多病因、多發病機制的老年退行性疾病，目前認為PD的發病可能與氧化應激、線粒體功能障礙、炎癥反應、興奮性氨基酸毒性、細胞凋亡、神經營養因子的下調、蛋白質異常折疊和集聚、鈣平衡紊亂等多種因素有關[14]。其中，氧化應激是帕金森病發病的核心因素[15]，抗氧化治療成為治療帕金森病確實有效的方案之一[16]。蓽茇具有廣泛的藥理活性和較強的抗氧化能力[17]。鑒于PD發病機制復雜，而中藥有效部位的多成分具有協同作用和整體調節等優勢，本實驗選擇含有多種酰胺類生物堿的蓽茇總生物堿有效部位作為研究對象，考察其對6-OHDA致大鼠PD模型損傷的DA能神經元的保護作用，并從抗氧化作用來探討其可能的保護機制。在大鼠的行為學評價方面，通過外周給予DA受體激動劑APO可誘發大鼠向健側產生旋轉行為，記錄一定時間內APO誘導的旋轉次數，可以對PD的損傷程度進行量化，作為判斷模型成功與否以及藥物治療作用的標準[18]。本實驗結果表明，采用腦立體定位注射6-OHDA制備紋狀體單側毀損的PD大鼠，在APO誘導后出現明顯的旋轉行為，且在轉棒上的滯留時間縮短，該行為與大鼠黑質TH陽性神經元的損傷以及紋狀體內DA含量的減少程度有關[19]。通過TH免疫組化染色顯示了PD大鼠模型中腦黑質TH陽性細胞及紋狀體中TH陽性纖維表達減少，證明6-OHDA單側紋狀體注射造成大鼠黑質大量DA能神經元脫失，因而經黑質-紋狀體通路投射到紋狀體的DA神經遞質減少。這一結果與行為學結果一致。PLA干預6周后，則能明顯改善PD大鼠的行為異常，增加黑質區TH陽性細胞數及紋狀體TH陽性纖維密度，從而推測PLA對DA神經元具有一定保護作用。

　　研究表明氧化應激和自由基損傷在PD的發病和發展過程中起著重要的作用，正常生物體內存在著SOD，GSH-Px，CAT和GSH等抗氧化酶及非酶系統，在整個防御體制中，SOD歧化氧陰離子（O2-）為過氧化氫（H2O2），CAT催化分解H2O2為水（H2O）和氧（O2），GSH-Px利用GSH還原H2O2為H2O或醇類化合物，它們相互協調，通過抗氧化以及清除多余的自由基對機體起保護作用[20-21]。而6-OHDA誘導的PD模型處于氧化應激狀態，抗氧化保護系統SOD，GSH-Px，CAT和GSH等功能異常，導致氧化應激反應增強，氧自由基增多，引起過氧化脂質產物MDA的含量明顯升高[22-23]。而NO作為氧自由基的一種，其神經毒性在PD的發病中起著重要作用，在病理狀態下，NOS過量表達和NO含量升高，致使機體內過氧亞硝基的生成增多，從而誘導細胞的凋亡[24]。本實驗結果表明，6-OHDA誘導的PD大鼠黑質及紋狀體內SOD，GSH-Px，CAT的活力降低，NOS的表達升高，MDA和NO含量升高，GSH的含量降低，說明模型動物的抗氧化能力降低。而PLA干預后，提高了大鼠黑質及紋狀體內的SOD，GSH-Px，CAT的活力，降低NOS的表達及MDA和NO的含量，升高GSH的含量，表明PLA能提高6-OHDA誘導的PD大鼠抗氧化能力。

　　綜上所述，經過蓽茇總生物堿治療后，PD大鼠的神經元受損得到一定的修復，行為得到明顯改善，而機體抗氧化能力也明顯提高，說明蓽茇總生物堿對6-OHDA誘導的PD大鼠具有神經保護作用，并且這種保護作用可能與PLA的抗氧化作用有關。

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