川芎LigusticumchuanxiongHort.為傘形科藁本屬多年生草本植物，以根莖入藥，味辛、性溫，具有活血行氣、祛風止痛等功效[1]。川芎的主要藥效成分包括阿魏酸、總生物堿、內酯類化合物、揮發油和酚性成分等物質[2-3]。

　　[摘要]該文建立了HPLC同時測定川芎藥材中阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、洋川芎內酯A和藁本內酯含量的方法。用40%乙醇提取樣品中的藥效成分，采用SymmetryC18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱，0～5min，乙腈-甲醇-1%冰醋酸（20∶40∶40），5～30min，乙腈-甲醇-1%冰乙酸（60～100∶0∶40～0）為流動相，流速lmL・min-1，檢測波長0～4.3min，321nm，4.31～30min，275nm，柱溫35℃，進樣體積10μL，應用安捷倫1100系列液相色譜儀進行測定。5種藥效成分的分離效果良好，在相應的濃度范圍內與峰面積有良好的線性關系，相關系數均大于0.99，加樣回收率（n=6）均在94.44%～103.1%。該方法應用于研究都江堰產區（海拔600m左右）不同采收期對川芎阿魏酸和4種內酯類物質含量的影響，試驗在4月15日（栽后245d）至5月30日（290d）內設置了10個采收期，發現5種藥效成分的含量與采收期（栽后天數）均呈二次或三次函數關系，隨著采收期的推遲而先增后減，阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、洋川芎內酯A和藁本內酯的含量在栽后260～265d（4月30日至5月5日）最高。

　　[關鍵詞]藥劑師論文投稿,川芎,HPLC,采收期,含量

　　目前川芎的質量評價主要以《中國藥典》2010年版（一部）的質量規范為標準，對川芎性狀、阿魏酸的含量（≥0.1%）、水分（≤12%）、總灰分（≤6%）、酸不溶性灰分（≤2%）、浸出物（≥12%）做了相關規定[1]。僅以阿魏酸一種藥效成分來評價川芎品質的高低有失偏頗，作者一致認為加之其他藥效成分綜合評價更為合理。如今測定阿魏酸單一成分含量的方法較多[4-9]，也有單一測定藁本內酯的方法[10]，或阿魏酸與川芎嗪、阿魏酸與藁本內酯2種成分同時測定的方法[11-12]，還有一些有關成分測定和川芎指紋圖譜建立的方法[5-6，13-16]，總之，這些方法只是單一成分及少數成分的定量測定，或是指紋圖譜中沒有確定具體成分、結構及藥效作用，只是對所測的材料確定了共有峰的數量及相對面積大小（不能代表藥材中的真實含量），且存在耗時較長和溶液消耗較多的缺點，均不利于對川芎藥材品質的綜合評價，需要建立一套能同時測定多種藥效成分的快捷、高效而可靠的分析方法，以便全面、正確地綜合評價川芎藥材的品質。

　　另外，不同的采收期對川芎的品質影響較大，蔣桂華和饒凡[17-18]等對川芎的采收期有過研究，遺憾的是其涉及的采收期較少或只測定阿魏酸、生物堿和揮發油3個指標的含量，不足以篩選川芎的最適采收期；近年來，隨著種植結構和耕作制度的改變，川芎的收獲期逐漸提前，位于四川彭山縣的川芎產區也是雜交水稻的制種區，為保證制種水稻提前栽秧，川芎的采收期提前到了4月上中旬；位于都江堰和彭州市的川芎主產區，主要實行的是川芎-水稻輪作制，為了提高水稻產量，所選用水稻品種的生育期呈延長之勢，也在一定程度上影響了川芎的適時收獲。因此，系統研究川芎采收期特別是早收對川芎品質的影響可為川芎的生產提供理論依據。

　　本文建立了HPLC同時測定川芎藥材中阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、洋川芎內酯A和藁本內酯含量的方法，為川芎藥材及相關產品的品質評價提供新的方法參考，同時研究川芎采收期對川芎品質的影響對川芎的優質高產栽培及川芎-水稻輪作制度有重要意義。

　　1材料

　　安捷倫1100LC系列液相色譜儀，ChemStation化學工作站、VWD檢測器；CAP225D電子天平（德國賽多利斯科學儀器有限公司），SB-5200DTD超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

　　試驗材料培養于川芎藥材采收期試驗田，川芎苓種來自都江堰市三江鎮，2011年8月10日栽種在都江堰市石羊鎮廣益村試驗田，土地平整，地力均一，pH為5.83，堿解氮58.34mg・kg-1，速效磷114.27mg・kg-1，速效鉀42.31mg・kg-1，有機質23.82g・kg-1。試驗采用單因素隨機區組設計，設置10個采收期，分別為2012年4月15日（栽后245d，下同）、2012年4月20日（250d）、2012年4月25日（255d）、2012年4月30日（260d）、2012年5月5日（265d）、2012年5月10日（270d）、2012年5月15日（275d）、2012年5月20日（280d）、2012年5月25日（285d）和2012年5月30日（290d）。重復3次，共30個處理，試驗小區面積為20m2。施肥[19]、密度[20]及其他栽培管理措施保持小區間一致。

　　甲醇（HPLC級）和乙腈（HPLC級）購買于賽默飛世爾科技股份有限公司，乙醇（HPLC級）和冰乙酸（AC級）購買于成都科龍化工試劑廠，超純水由娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）代替，標準對照品阿魏酸和藁本內酯購買于中國食品藥品檢定研究院，洋川芎內酯I、洋川芎內酯H和洋川芎內酯A購于四川省中藥標準中心。

　　2方法與結果

　　2.1色譜條件

　　SymmetryC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相為0～5min，乙腈-甲醇-1%冰醋酸（20∶40∶40），5～30min，乙腈-甲醇-1%冰乙酸（60～100∶0∶40～0）；流速lmL・min-1；檢測波長0～4.3min，321nm，4.31～30min，275nm；柱溫35℃，進樣體積10μL。2.2對照品溶液的制備

　　分別準確稱取阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、洋川芎內酯A和藁本內酯等5種對照品32.000，50.000，50.000，50.000，100.000mg，用甲醇定容到100mL，搖勻，即得對照品儲備溶液。分別準確吸取一定量的上述儲備液于10mL量瓶中，用40%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得到0，3.2，6.4，12.8，19.2，25.6，32.0，64.0mg・L-1的阿魏酸對照品溶液0，25，50，100，200，300，400，500mg・L-13種洋川芎內酯（I，H和A）對照品溶液和0，0.050，0.100，0.200，0.300，0.400，0.500，1.000g・L-1的藁本內酯對照品溶液。

　　2.3供試品溶液的制備

　　2.3.1回流提取法取川芎樣品0.5g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密加入40%乙醇50mL，稱重，加熱回流提取30min，放冷，再稱定質量，用40%乙醇補足失重，搖勻，靜置，取上清液，濾過，續取濾液，0.45μm微孔濾膜濾過，注入高效液相色譜儀，見圖1。

　　2.3.2超聲提取法取川芎樣品0.5g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密加入40%乙醇50mL，稱重，超聲提取30min（200W，40℃），放冷，再稱定質量，用40%乙醇補足失重，搖勻，靜置，取上清液，濾過，續取濾液，0.45μm微孔濾膜濾過，注入高效液相色譜儀，見圖1。

　　結果表明加熱回流法與超聲波法對提取川芎藥材中的阿魏酸和洋川芎內酯H的含量差異顯著，超聲法提取效果更佳，其余3種內酯類物質的含量差異不顯著，由于超聲波法對藥效成分的提取操作更加簡便，且效率更高，在工作過程中放出的熱量更少，故本文選用超聲波優化提取法[21]作為提取川芎藥材中上述5種主要藥效成分的方法。

　　2.4方法學考察

　　2.4.1線性關系精密吸取2.2項下稀釋的對照品標準溶液10μL注入液相色譜儀，平行測定3次，取平均峰面積。以進樣量（X，μg）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線并進行回歸計算，得到阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、洋川芎內酯A和藁本內酯的回歸方程分別為Y=73.630X+1.888（R2=1.000），Y=33.922X-4.682（R2=0.999），Y=6.117X-3.739（R2=0.999），Y=4.664X+0.493（R2=0.999）和Y=9469.800X+4.622（R2=0.999），分別在0.049～64，0.785～500，2.334～500，0.188～500，0.025～1000mg・L-1線性關系良好。

　　2.4.2精密度試驗精密吸取2.3.2項下提取的川芎樣品溶液10μL，連續進樣8次，測得上述5種藥效成分的峰面積RSD均小于2%，表明儀器具有良好的精密度。

　　2.4.3重復性試驗取同一批川芎樣品6份，按2.3.2項下方法制備樣品溶液，吸取10μL注入液相色譜儀，結果顯示上述5種藥效成分峰面積的RSD分別為1.8%，0.90%，0.30%，0.44%，1.1%，表明超聲法提取重復性良好。

　　2.4.4穩定性試驗取同一樣品溶液，室溫放置，并分別于0，1，2，4，12，24，48h進行測定，結果顯示上述5種藥效成分峰面積RSD均小于1.6%，表明樣品溶液在48h內穩定。

　　2.4.5回收率試驗精密稱取已知含量的樣品0.5g，共6份，精密稱定并加入阿魏酸0.46mg、洋川芎內酯（I，H和A）和藁本內酯各0.5mg，按2.3.2項下方法制備樣品，加樣回收率按如下公式計算：回收率（%）=（測得量-樣品中量）/加入量×100。結果顯示上述5種藥效成分的平均加樣回收率，見表1，分別為103.1%，94.44%，96.61%，97.55%和95.22%。

　　2.5樣品測定

　　分別取不同采收期的川芎樣品，按2.3.2項下方法制備樣品溶液，按2.1項下色譜條件測定，利用已建立的標準曲線計算樣品中的阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、洋川芎內酯A和藁本內酯含量，見圖2。

　　10次采收期樣品的平均阿魏酸質量分數為2.51mg・g-1，在260d時采收的樣品質量分數最高，為2.94mg・g-1，比平均含量高17.1%，顯著高于除255d之外的其他8個采收時期，與255d采收的川芎阿魏酸含量差異在0.05水平時不顯著，在245，285，290d采收的阿魏酸含量最低，分別比平均含量低21.8%，4.1%，12.1%，而最高含量比最低含量高出了42.7%。洋川芎內酯Ⅰ的平均質量分數為0.58mg・g-1，270d時采收的樣品質量分數最高，達0.70mg・g-1，比平均含量高20.69%，顯著高于其他各采收期的含量，290d采收時的洋川芎內酯Ⅰ質量分數最低，僅0.44mg・g-1，比270d時采收的樣品含量低59.1%。245，260d時采收的樣品洋川芎內酯H質量分數最高，分別為2.19，2.15mg・g-1，在α=0.05水平時與其他各采收期的樣品含量差異顯著，除245d采收的樣品外，隨著采收期推遲其含量呈先增加后降低的現象，290d采收時的洋川芎內酯H質量分數最低，僅1.25mg・g-1，比260d采收的樣品含量低67.8%。洋川芎內酯A和藁本內酯的質量分數均在260d采收時最高，分別為15.21，31.35mg・g-1，與其他各采收期樣品的含量差異顯著，290d采收時其含量均最低，分別比最高含量低63.0%，35.0%。隨著采收期的推遲，川芎藥材中5種主要藥效成分的含量呈先增加后減小的變化趨勢，其含量與采收期均呈二次或三次函數關系，并建立了相關的數學模型。通過上述5種藥效成分的含量與采收期的數學模型可知，早收和晚收均不利于提高川芎藥材的品質，255～270d期間采收川芎藥材的阿魏酸、洋川芎內酯I和藁本內酯的含量最高，250～260d期間采收川芎藥材的洋川芎內酯H和洋川芎內酯A的含量最高。綜合上述5種主要藥效成分含量和實際生產情況的角度來分析，260～265d為最佳采收時期，此時川芎生長最旺盛，隨后開始逐漸衰老，藥效成分的含量慢慢降低。

　　3討論

　　3.1HPLC同時測定川芎5種藥效成分含量的方法

　　中藥材的質量評價正向快速、高效、樣品前處理簡單、高重復性、低成本、容易操作的方向發展。HPLC是中藥材及中藥飲片品質評價常用的方法，在川芎上常被用于構建指紋圖譜[5-6，13-16]來評價不同產地和不同品種的藥材的品質，但一般沒有具體藥效成分的含量；也有一些測定阿魏酸、川芎嗪、揮發油、香草醛、內酯類等單一成分或其中2～4種成分測定方法方面的報道[4-12]，由于同時測定的成分少，測定的效率不高，至今鮮見同時測定阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、洋川芎內酯A和藁本內酯等多種成分方面的研究。

　　同時對色譜溶劑（乙腈和甲醇）與不同濃度的乙酸和水組成的流動體系（甲醇-水、甲醇-乙酸、乙腈-水、乙腈-乙酸和甲醇-乙腈-乙酸等）、柱溫（25，30，35，40，45℃）和流速（0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2mL・min-1）等單變量（因素）試驗，優化出了HPLC同時測定阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、洋川芎內酯A和藁本內酯含量，即選用流動相為0～5min，乙腈-甲醇-1%冰醋酸（20∶40∶40），5～30min，乙腈-甲醇-1%冰乙酸（60～100∶0∶40～0），流速lmL・min-1，檢測波長0～4.3min，321nm，4.31～30min，275nm，柱溫35℃，進樣體積10μL。本文通過對測定方法的考察，建立了高重復性、快速的川芎藥材中主要藥效成分含量的測定方法且線性、精密度、重復性和回收率均良好，洗脫時間僅為30min同時測定川芎藥材中5種重要的藥效成分，大大的提高了工作效率，同時也降低了測定成本，且所測定樣品的藥效成分含量與之前報道的結果一致[5，7-8，16，22-24]，所以本測定方法可以全面應用于川芎藥材的品質評價。

　　3.2采收期對川芎5種藥效成分含量的影響

　　川芎的品質不僅因產地[10]、品種而異，也受耕作方式[25]、施肥技術[22-24]等生產技術的影響。蔣桂華[17]、饒凡[18]等研究認為采收期對川芎的品質也有較大影響，但前者研究的時期是5月20日及其前后10d共3個時期，且結果在年度和地點不盡一致；而后者研究的時間從頭年12月至次年6月，時間間隔過大，對生產上主要采收時間（5月上旬至中旬）分析不夠。本文采用單因素隨機區組試驗方法，從4月15日（245d）起每5天采收1次直至5月30日（290d）止，共10個采收期，采用上述建立的方法，分析了都江堰產區（海拔600m左右）每個采收期樣品的阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、洋川芎內酯A和藁本內酯共5種藥效成分的含量，并建立了其與采收期的回歸關系，發現采收期對這5種成分均有顯著影響，隨著采收期的推遲，5種藥效成分的含量均呈現先增后減的趨勢，采收過早過晚都會降低各藥效成分的含量，綜合考慮阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、洋川芎內酯A和藁本內酯的含量，確定最佳采收期為4月30日（260d）至5月5日（265d）。

　　[參考文獻]

　　[1]中國藥典.一部[S].2010：38.

　　[2]常新亮，馬云保，張雪梅，等.川芎化學成分研究[J].中國中藥雜志，2007，32（15）：1533.

　　[3]曹建敏，王宗花，丁明玉.反相高效液相色譜法同時測定川芎中的四種內酯類化合物[J].色譜，2005（9）：531.

　　[4]金月，李江.RP-HPLC法測定川芎藥材中阿魏酸的含量[J].西北藥學雜志，2010，25（2）：85.

　　[5]劉小麗，石麗，李華.川芎藥材HPLC指紋圖譜及阿魏酸測定研究[J].中成藥，2011，33（8）：1289.

　　[6]劉洋，石任兵，劉斌，等.川芎藥材化學成分HPLC指紋圖譜研究[J].北京中醫藥大學學報，2006，29（5）：335.

　　[7]呂光華，程世瓊，陳金泉，等.HPLC測定川芎藥材和飲片中游離阿魏酸和總阿魏酸的含量及其質量評價指標[J].中國中藥雜志，2010，35（2）：194.

　　[8]王妙聞，張藝，張靜，等.HPLC測定川芎中的總阿魏酸[J].華西藥學雜志，2008，23（1）：100.

　　[9]王漪檬，張暉芬，閆寶慶，等.HPLC法同時測定川芎藥材中3種有效成分的含量[J].藥物分析雜志，2009（12）：2109.

　　[10]程世瓊，呂光華，梁士賢，等.不同產地川芎中藁本內酯的含量及其質量指標[J].中國中藥雜志，2006，31（14）：1143.

　　[11]劉毅，劉素香，張鐵軍.HPLC法測定川芎中阿魏酸和藁本內酯[J].藥物評價研究，2010，33（3）：210.

　　[12]雷志丹，雷志鈞，戴玲.HPLC同時測定川芎中川芎嗪和阿魏酸的含量[J].中國醫藥導報，2011，8（9）：57.[13]徐蘭蘭，蕭偉，秦建平.川芎藥材的HPLC指紋圖譜研究[J].南京中醫藥大學學報，2009，25（2）：150.

　　[14]楊佰娟，陳軍輝，殷月芬.川芎HPLC-APCI-MS特征圖譜方法研究[J].天然產物研究與開發，2007，19（B05）：12.

　　[15]宋金春，胡傳芹，曾俊芬，等.川芎RP-HPLC指紋圖譜的建立及其質量研究[J].中國藥師，2006，9（4）：297.

　　[16]姚宗玲，杜守穎，陸洋，等.RP-HPLC同時測定不同來源川芎中5種有效成分的含量[J].中國中藥雜志，2010，35（20）：2696.

　　[17]蔣桂華，賈敏如，馬逾英.川芎的適宜采收期和加工方法[J].華西藥學雜志，2008，23（3）：312.

　　[18]饒凡，楊寧寧，許靜.川芎不同采收期的質量對比研究[J].華西藥學雜志，2001，16（3）：183.

　　[19]劉金亮.氮磷鉀肥配施對川芎生長、產量和藥效成分含量的影響[D].成都：四川農業大學，2011.

　　[20]陳春霞.配方肥用量與種植密度對川芎生長發育和產量的影響[D].成都：四川農業大學，2012.

　　[21]LiuJL，ZhengSL，FanQJ，etal.Optimizationofhigh-pressureultrasonic-assistedsimultaneousextractionofsixmajorconstituentsfromLigusticumchuanxiongRhizomeusingresponsesurfacemethodology[J].Molecules，2014，19（2）：1887.

　　[22]范巧佳，劉靈，鄭順林，等.春季施氮時期和數量對川芎產量、生物堿和阿魏酸的影響[J].四川農業大學學報，2013，31（2）：136.

　　[23]范巧佳，張毅，楊世民，等.氮素形態對川芎生長、產量與阿魏酸和總生物堿含量的影響[J].植物營養與肥料學報，2010，16（3）：720.

　　[24]張毅，范巧佳，鄭順林，等.春季追肥對川芎產量、阿魏酸和總生物堿含量的影響[J].中國中藥雜志，2008，33（16）：1944.

　　[25]范巧佳，藍天瓊，鄭順林，等.免耕稻草覆蓋對土壤肥力及川芎產量和品質的影響[J].西南農業學報，2013（3）：1066.