戊己丸是臨床上治療腸易激綜合癥、胃潰瘍等消化道疾病的常用方劑，是收錄于2010年版藥典中的經典名方，其在《幼幼新書》、《太平惠民合劑局方》、《醫方考》等歷代醫書中均有記載。戊己丸由黃連，吳茱萸和土炒白芍3味藥組成，然歷代醫書中記載的戊己丸配伍比例卻不盡相同，2010年版藥典收錄戊己丸由黃連-吳茱萸-土炒白芍6∶1∶6組成[1]。

　　[摘要]采用L9（34）正交設計將戊己丸中黃連，吳茱萸，白芍提取物組成9組配伍方，以及相應劑量的單味藥方，共計18個方。建立并采用UPLC-MS/MS方法測定并比較不同配伍方代表成分小檗堿、巴馬汀、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、芍藥苷在大鼠口服給藥2h后在肝臟中的濃度比較戊己丸不同配伍方中有效成分在大鼠肝臟中的濃度。結果顯示戊己丸配伍方中有效成分在肝中的濃度與相同劑量的單味藥組方存在明顯差異，相同劑量配伍方之間也存在差異。黃連與低、高劑量吳茱萸中吳茱萸堿濃度成正相關，吳茱萸與低劑量黃連中小檗堿的濃度成負相關，與中劑量黃連中小檗堿的濃度成正相關，與中劑量白芍中芍藥苷濃度成正相關。白芍與中劑量黃連中巴馬汀濃度成負相關、與中劑量吳茱萸中吳茱萸堿、吳茱萸次堿濃度成負相關。提示了黃連、吳茱萸、白芍之間相互作用導致了各活性成分在肝中分布的差異，分析顯示各代表成分2h在肝中濃度最大的配伍比為12∶6∶6。

　　[關鍵詞]藥劑師職稱論文,戊己丸,配伍,肝臟分布

　　有研究表明，戊己丸配伍不同，其藥效也不盡相同。王婭杰等[2]通過比較戊己丸提取物黃連-吳茱萸-白芍12∶2∶3與12∶1∶12的優選方對豚鼠離體結腸運動的影響，發現二者均可抑制乙酰膽堿誘導的結腸運動亢進，卻呈現出不同的作用特點和優勢。宮海民等[3]比較了2種不同配伍比例的戊己丸的藥效，發現黃連-吳茱萸-白芍1∶1∶1時長于鎮痛，5∶1∶1時長于抗炎。為此，本課題組采用藥代動力學的技術和手段，通過研究和比較戊己丸不同配伍組方有效成份在體內的吸收和處置情況，探究各單味藥之間的相互作用和配伍規律，進而闡釋戊己丸的配伍原理及機制。

　　肝是機體的最重要的代謝器官。課題組前期通過血藥濃度-時間曲線[4]以及體外肝微粒CYP450酶代謝模型[5-6]、肝灌流模型[7]研究發現，戊己丸配伍不同，體內的藥代動力學參數、對肝中CYP450酶的影響以及肝臟對各代表成份的攝取均存在明顯的差異。然而，藥物通常要分布到肝實質細胞里才能跟細胞內的代謝酶發生相互作用（生物轉化或影響代謝酶活性）抑或通過膽汁排泄[8]。因此，了解藥物在肝臟中的分布有著重要意義。

　　本實驗在之前研究的基礎上，采用正交設計，將戊己丸三味藥的提取物組成不同配伍方，以期通過研究各配伍方的在肝中的分布特征，更為深入的了解藥物在肝臟乃至體內的處置過程，同時冀求從分布的角度探索戊己丸配伍的規律及意義，為更深入的研究戊己丸的配伍機制提供基礎。

　　1材料

　　1.1動物

　　雄性Sprague-Dawley大鼠，SPF級，體重（220±20）g，中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所提供，合格證號SCXK（京）2009-0017。在恒溫，光照周期12h∶12h環境中飼養3d后實驗。

　　1.2儀器

　　超高效液相色譜-質譜聯用儀（WatersXevoTQMS-AcquityUPLCSystem，MasslynxV4.1工作站）；MSU225S-000-DU型1/10萬電子分析天平（德國Sartorius公司）；PotterS型勻漿機（德國Sartorius公司）；VX-Ⅲ型多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）；NA-5L型氮空一體機（北京中興匯利科技發展有限公司）；Centrifuge5424R型低溫高速離心機（德國eppendorf公司）；Milli-QAdvantageA10超純水系統（美國Millipore公司）。

　　1.3試劑與試藥

　　鹽酸小檗堿（Ber，批號110713-201212），鹽酸巴馬�。≒al，批號110732-201108），吳茱萸堿（Evo，批號110802-200606），吳茱萸次堿（Rut，批號110801-201006），芍藥苷（Pae，批號110736-201136），鹽酸苯海拉明（Dip，批號100066-200807），梔子苷（Gar，批號110749-200714），對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈，甲醇，甲酸均為色譜純（美國Fisher公司）。高純水（自制）。

　　黃連提取物、吳茱萸提取物、白芍提取物由中日友好醫院藥劑室提取，得率分別為19.3%，17.7%，9.37%，均為真空干燥固體粉末。其中各提取物中代表成分的質量分數分別為：黃連提取物中Ber23.03%，Pal5.52%；吳茱萸提取物中Evo0.38%，Rut0.48%；白芍提取物中Pae13.41%。本實驗配伍方為各單味藥提取物的混合，且全部實驗均采用同一批次的提取物。

　　2方法

　　2.1戊己丸配伍方設計

　　采用L9（34）正交設計，將戊己丸中黃連、吳茱萸、白芍3味藥作為不同因素，根據2010年版藥典臨床劑量及配比和歷代醫方記載之配比，設計各單味藥的高中低劑量，作為3個水平，得到9個配伍方（1#～9#），同時設3味藥相應劑量的單味藥對照（10#～18#）。共計18個組方，見表1。

　　2.2標準溶液的配制

　　精密稱取適量的Ber，Pal，Evo，Rut，Pae，Dip，Gar對照品，用甲醇溶解，分別配制成100，100，25，25，20mg・L-1，1，2g・L-1的儲備液，于4℃冰箱中保存，備用。2.3給藥與臟器采集

　　90只大鼠隨機分成18組，禁食12h后，以20μL・g-1的灌胃體積灌胃1～18號方戊己丸提取物溶液。灌胃后2h放血脫脊椎處死大鼠，迅速取出肝組織，生理鹽水洗凈表面血跡，用濾紙吸干表面水分。稱重記錄，于-80℃冰箱中保存備用。

　　2.4組織樣品預處理方法

　　將于-80℃冰箱中保存的給藥組肝組織及空白組肝組織取出，室溫下解凍。按3mL・g-1的量加入含10%氨水的生理鹽水在冰浴中勻漿。取270μL給藥組肝勻漿液，加30μL甲醇溶液，加30μL內標（Dip2mg・L-1，Gar20mg・L-1），加1470μL乙腈沉淀蛋白，以4℃，12000r・min-1離心15min，取上清液1500μL，25℃氮氣吹干。殘渣用1800μL含有1%甲醇的乙酸乙酯溶解，4℃，12000r・min-1離心15min，取上清液1440μL，25℃氮氣吹干。殘渣用250μL50%乙腈再次溶解，3μL進樣分析。

　　2.5樣品分析條件

　　2.5.1液相條件WatersAcquityUPLCSystem，ACQUITYUPLCBEHShieldRP18色譜柱（2.1mm×50mm，1.7μm）；流動相A為乙腈，B為0.2%甲酸；采用梯度洗脫，單個樣品分析時間為7min；0～3.5min，2%～40%A；3.5～4.5min，40%～80%A；4.5～5.0min，80%～90%A；5.0～5.5min，80%～90%A；5.5～6.0min，90%～40%A；6.0～6.1min，40%～2%A；6.1～7.0min，2%A；流速0.4mL・min-1，柱溫35℃。

　　2.5.2質譜條件采用電噴霧電離離子源（ESI），正負離子模式同時檢測，選擇MRM模式進行二級質譜分析。其中Ber（m/z335/320），Pal（m/z352/336），Evo（m/z304/134），Rut（m/z288/115），Dip（m/z256/152）在正離子模式下檢測，毛細管電壓1.00kV，錐孔電壓50V，離子源溫度150℃，脫溶劑溫度500℃，脫溶劑氣體流速800L・Hr-1，錐孔氣體流速50L・Hr-1，碰撞能20eV；負離子模式下檢測Pae（m/z525/449），Gar（m/z387/225），毛細管電壓2.50kV，錐孔電壓32V，離子源溫度150℃，脫溶劑溫度500℃，脫溶劑氣體流速800L・Hr-1，錐孔氣體流速50L・Hr-1，碰撞能8eV。

　　2.6方法學評價

　　2.6.1方法專屬性將空白肝勻漿、加有檢測成份的空白肝勻漿及灌胃后的肝勻漿按2.4項下樣品處理方法進樣對比分析。

　　2.6.2標準曲線與線性范圍取對照品儲備液，用甲醇稀釋成不同濃度的混標溶液。其中Ber和Pal為20，50，100，200，400，600，800，1200，1600，2000μg・L-1；Evo和Rut為5，12.5，25，50，100，150，200，300，400，500μg・L-1；Pae為4，10，20，40，80，120，160，240，320，400μg・L-1。

　　取空白肝組織勻漿液270μL，加入30μL上述不同濃度的混標溶液，加30μL內標溶液。按2.4項下樣品處理方法制備進樣，以各樣品質量濃度（X）為橫坐標，以檢測樣品峰面積與內標峰面積的比值（Y）為縱坐標，采用加權最小二乘法進行線性回歸（權重1/X2），得回歸方程。

　　2.6.3日內、日間精密度及準確度以空白肝組織樣品，根據線性范圍不同，選取高濃度混標（Ber和Pal1600μg・L-1，Evo和Rut400μg・L-1，Pae320μg・L-1），中濃度混標（Ber和Pal400μg・L-1，Evo和Rut100μg・L-1，Pae80μg・L-1），低濃度混標（Ber和Pal50μg・L-1，Evo和Rut12.5μg・L-1，Pae10μg・L-1），按2.4樣品處理方法，制備成高、中、低3個濃度的質控樣品。并將3個濃度樣品分別制備5份，連續檢測3d。根據隨行標準曲線計算日內、日間精密度和準確度。

　　2.6.4回收率空白肝組織勻漿液，取30μL50%乙腈代替2.4項樣品處理方法中的內標，制備高中低3個濃度的樣品，每個濃度平行制備8份，記錄峰面積。并與相應濃度實際進樣量的標準溶液峰面積相比，計算絕對回收率。

　　2.6.5穩定性考察各代表成分及內標的穩定性包括：儲備液的長期穩定性（儲備液在-80℃條件下保存4個月）；大鼠肝勻漿樣品中長期穩定性（肝勻漿在-80℃保存1個月）；大鼠肝勻漿樣品在前處理過程中的穩定性及凍融穩定性（肝勻漿室溫下放置3h后提取及反復凍融一次后提�。�；在復溶溶劑中的短期穩定性（4℃自動進樣器中放置24h）。

　　2.7數據處理

　　質譜數據采用Waters公司Masslynx4.1工作站進行峰提取，峰積分等處理；采用內標法，用線性回歸方程計算各成分在肝臟中的濃度，權重因子1/X2，其中Ber，Pal，Evo，Rut選取Dip作為內標，Pae選取Gar作為內標；采用SPSS19.0對數據進行分析，結果以柱狀圖（±s）來表示。組間比較采用t檢驗，顯著性檢驗水平設為α=0.05。選擇5種化合物濃度的平均值作為指標進行正交設計方差和極差分析，確定對于各代表成分的最優配伍組合及對全方的貢獻度、貢獻形式。3結果與分析

　　3.1方法學結果

　　3.1.1方法專屬性結果表明Ber，Pal，Evo，Rut，Pae以及內標Dip，Gar峰型良好，臟器中的內源性物質對檢測沒有干擾，檢測成份相應值較高，方法專屬性良好，見圖1。

　　3.1.2標準曲線與線性范圍按2.6.2下配制標準品并得到標準曲線，各成分線性范圍及回歸方程，見表2。

　　3.1.3日內、日間精密度及準確度結果顯示，高中低3個濃度的Ber，Pal，Evo，Rut，Pae日內準確性為93%～105%，其精密度2.6%～13.2%；日間準確性為96%～106%，其精密度為2.6%～12.1%。準確度均在（100±10）%，精密度均在15%以內，符合生物樣品分析方法的要求，見表3。

　　3.1.4回收率結果顯示各代表成分高中低3個濃度的回收率穩定，RSD均在15%以內，符合生物樣品分析方法的要求，見表4。

　　3.1.5穩定性實驗結果表明，儲備液在-80℃下保存4個月各成份均穩定未變。肝勻漿樣品在-80℃保存1個月所有被測成份峰面積基本未變。質控樣品勻漿液在室溫下放置3h后提取，各成份峰面積基本不變。質控樣品復溶液在4℃自動進樣器中放置24h，峰面積基本穩定。質控樣品凍融1次后再提取，各代表成分峰面積均有顯著降低，因此實驗保證在解凍后均一次性處理。

　　3.2給藥肝組織樣品測定與分析

　　取2.4項下樣品分析，測定各配伍方中Ber，Pal，Evo，Rut，Pae給藥后2h在肝中的濃度。

　　3.2.1不同配伍方對Ber分布的影響統計各配伍方Ber濃度，結果顯示①黃連低劑量組Ber濃度大小為1#>10#>2#>3#，而吳茱萸用藥量為3#>2#>1#，提示與吳茱萸的用藥量成負相關，低劑量的吳茱萸可以促進Ber在給藥2h后在肝中的濃度。②黃連中劑量組Ber濃度為6#>5#>11#>4#，吳茱萸用藥量為6#>5#>4#，提示與吳茱萸用藥量成正相關，高劑量的吳茱萸促進Ber在給藥2h后在肝中的濃度。③黃連高劑量組配伍方中Ber濃度均大于同劑量單味藥方（P<0.05），提示配伍方可以顯著提高Ber在給藥2h后在肝臟中的濃度，其中9#>7#>8#，見圖2。

　　3.2.2不同配伍方對Pal分布的影響統計各配伍方Pal濃度，結果顯示①黃連低劑量組配伍方中Pal濃度均大于同劑量單味藥方（P<0.01），提示配伍方可以顯著提高Pal在給藥2h后在肝中的濃度。②黃連中劑量組配伍方中Pal濃度均小于同劑量單味藥方，提示配伍方抑制了Pal的在肝中的濃度；其中6#>4#>5#，而白芍用藥量為5#>4#>3#，與白芍的用藥量成負相關，提示白芍可以抑制Pal給藥2h后在肝中的濃度。③高劑量組配伍方Pal濃度均顯著大于同劑量單味藥方（P<0.01），提示配伍方可以顯著提高Pal在給藥2h后在肝中的濃度，見圖3。

　　3.2.3不同配伍方對Evo分布的影響統計各配伍方Evo濃度，結果顯示①吳茱萸低劑量組Evo濃度為7#>4#>13#>1#，黃連與白芍的用藥量為7#>4#>1#，提示與黃連和白芍的用藥量成正相關，高劑量的黃連與白芍可以促進Evo在給藥2h后在肝中的濃度；②吳茱萸中劑量組配伍方中Evo濃度均小于同劑量單味藥方，其中8#>2#>5#，白芍的用量為5#>2#>8#，提示與白芍的用量成負相關，白芍抑制了Evo在給藥2h后在肝中的濃度；③高劑量組配伍方Evo濃度均小于同劑量單味藥方（P<0.01），提示配伍方抑制Evo在給藥2h后在肝中的濃度；其中9#>6#>3#，黃連的用藥為9#>6#>3#，提示與黃連的用藥成正相關，見圖4。

　　3.2.4不同配伍方對Rut分布的影響統計各配伍方中Rut濃度，結果顯示①低劑量組配伍方中Rut濃度均大于同劑量單味藥方（P<0.01），提示配伍方可顯著促進Rut給藥2h后在肝中的濃度；②中劑量組配伍方Rut濃度均小于同劑量單味藥方，其中8#>2#>5#，同時白芍的用量為5#>2#>8#，提示與白芍的用量成負相關，白芍抑制Rut在給藥2h后在肝中的濃度；③高劑量組配伍方中Rut濃度均大于同劑量單味藥方（P<0.01），提示配伍方可以提高Rut在給藥2h后在肝中的濃度，見圖5。

　　3.2.5不同配伍方對Pae分布的影響統計各配伍方中Pae濃度，結果顯示①白芍低、中劑量組單味藥組方（16#，17#）中Pae濃度均低于定量下限，而配伍方中Pae濃度均高于定量下限，提示白芍低、中劑量時配伍方可以顯著提高Pae在給藥2h后在肝中的濃度；②其中白芍中劑量組為9#>2#>4#，吳茱萸用量為9#>2#>4#，提示與吳茱萸用量成正相關；③高劑量組5#Pae濃度低于定量下限，配伍方中7#高于18#（P<0.01），3#低于18#，見圖6。

　　3.2.6各代表成分正交方差分析、極差分析結果以各代表成分在2h肝濃度的平均值為指標，通過正交設計方差分析及極差分析確定相對于各代表成分的最優組合，以及各因素間的主次關系、貢獻形式以及貢獻度大小，見表5。貢獻度表示各因素對代表成分在肝中濃度的影響程度，貢獻度越大說明其對代表成分分布濃度影響越大，貢獻形式分為促進分布（+，正相關）與抑制分布（-，負相關），由此得到的影響因素的大小排序即為貢獻度排序。從統計結果中可以看出，黃連對Ber，Pal，Pae在肝中濃度起主要作用，其次為吳茱萸和白芍；且黃連與Ber，Pal為正相關，即增大黃連的用量可以增大Ber，Pal在肝中的濃度，黃連用量與Pae沒有表現出明顯的相關性；對于Evo，三味藥的主要貢獻度為吳茱萸>黃連>白芍，其中吳茱萸對Evo為負相關，黃連對Evo為正相關，即增大黃連的用量，減少吳茱萸的用量可以增大Evo的濃度大小；對于Rut，三味藥的主要貢獻度為吳茱萸>白芍>黃連，且吳茱萸與Rut成正相關，及增大吳茱萸的用量，可以提高Rut在肝中的濃度。當黃連-吳茱萸-白芍12∶6∶6時可使Ber，Pal，Evo，Rut濃度最大；使Pae濃度最大的配伍比為黃連-吳茱萸-白芍12∶1∶6。因此，綜合考慮5個代表成分，得出戊己丸在2h在肝臟中濃度最大的最優配伍比為黃連-吳茱萸-白芍12∶6∶6。4小結與討論

　　組織中的藥物通常因為含量較低而不易測出，為此，本實驗采用了液質聯用的技術手段，同時選擇了較傳統HPLC有著更高柱效與分離度的UPLC液相系統及1.7μm粒徑的UPLC柱，大大縮短了分析時間。比較了各成份在ESI與APCI2種不同電離模式下響應情況，選擇了ESI離子源。同時選擇Dip，Gar雙內標來分析中正負離子模式同時監測。

　　被測成份Ber，Pal，Evo，Rut均具有堿性，堿化樣品有助于提高整個處理過程的回收率，因此本實驗采用含10%氨水的生理鹽水勻漿，堿化勻漿液。為了達到良好的檢測效果，同時避免組織中雜質對樣品和儀器造成的干擾和污染，樣品預處理通過蛋白沉淀后2次復溶，在保證方法穩定可靠的同時，確保了將蛋白及極性較大的內源性雜質的干擾和污染降至最低，同時延長了色譜柱的使用壽命。

　　肝組織及其勻漿液中含有大量藥物代謝酶，本實驗采取多種措施以保證各檢測成份在分析過程中的穩定性。包括臟器取出稱重后立即放于-20℃冰箱中并轉移至-80℃冰箱中保存直至勻漿；肝勻漿后立即進行提取處理，為防止反復凍融，減少1次勻漿的數量，確保一次性處理完畢；樣品復溶后立即放置于-4℃自動進樣器中；所用標準溶液均按每次實驗的用量計算分裝，并于-80℃冰箱中保存，解凍后均一次性使用。

　　根據前期藥代動力學研究得到的血藥濃度-時間曲線[4]，本實驗選擇2h作為考察時間點，此時各代表成分在組織和血液之間的分布基本已達到平衡。根據各代表成分濃度之間的比較分析，結果顯示給藥2h后①對于Ber：隨著黃連用量的增大，Ber在肝中的濃度逐漸增大。大劑量配伍方可以顯著提升Ber在肝中的濃度；黃連用量為低、中劑量時，Ber的分布均與吳茱萸有關，低劑量的吳茱萸對低劑量黃連組Ber的濃度有著促進作用，而對中劑量黃連組為抑制作用。②對于Pal：其濃度大小均與黃連的用量成正相關，當黃連用量為低、高劑量時，配伍可以顯著提高Pal的濃度；黃連中劑量時，配伍略微抑制Pal的分布，主要抑制因素為白芍，隨著白芍用量增大，抑制作用增強。③對于Evo：隨著吳茱萸用量的增加，Evo在肝中的濃度增大，但配伍方對Evo濃度的抑制作用隨之加大；當吳茱萸低劑量時，低劑量的黃連和白芍Evo的作用為抑制，而增大二者的用量，則促進Evo在肝中的濃度；吳茱萸中劑量時，白芍為主要作用因素，隨白芍用量增大Evo濃度減小，吳茱萸高劑量時，黃連為主要作用因素，隨著黃連用量減少，Evo濃度減小。④對于Rut，隨著吳茱萸用量的增大，Rut濃度增大，當吳茱萸用量為低、高劑量時，配伍方對Rut濃度大小起促進作用，吳茱萸用量為中劑量時，配伍方對Rut起抑制作用，且白芍為主要因素，隨白芍用量增加，對Rut的抑制作用增加。⑤對于Pae：白芍用量低、中劑量時，配伍方可以顯著提高Pae的濃度，且中劑量時隨著吳茱萸用量的增加，Pae濃度加大。

　　通過正交方差分析與極差分析，結果顯示，增大黃連的用量可以增大Ber，Pal，Evo在肝中的濃度；增大吳茱萸的用量可以增大Rut在肝中的濃度，降低Evo在肝中的濃度；初步得到戊己丸在肝中濃度最大的配伍組合為黃連-吳茱萸-白芍12∶6∶6。

　　本實驗僅從組織分布的角度初步探索了戊己丸的配伍規律，然而中醫藥理論博大精深，影響藥物體內分布的因素環節又復雜多樣。因此，如何借助藥代動力學的技術和手段，從多層次多角度去探討方劑的配伍機制，仍是筆者今后努力的方向。

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