地榆總皂苷（DYS）促造血作用已從體內(nèi)外研究中獲得證實(shí)[1]，作者前期的研究發(fā)現(xiàn)[2]，DYS可單獨(dú)或協(xié)同細(xì)胞因子促進(jìn)造血細(xì)胞增殖，尤其，DYS單獨(dú)處理能顯著增加依賴促血小板生成素（TPO）生長的Baf3/Mpl細(xì)胞增殖，且在mRNA水平促進(jìn)TPO受體（TPOR）的表達(dá)。

　　[摘要]目的：觀察地榆總皂苷（DYS）對Baf3細(xì)胞和32D細(xì)胞的促增殖和分化作用，以及對IL-3受體和干細(xì)胞因子受體c-kit表達(dá)水平的影響。方法：培養(yǎng)依賴IL-3生長的Baf3細(xì)胞和32D細(xì)胞，在加或不加IL-3條件下，用質(zhì)量濃度為5，10，20，30，40mg・L-1的DYS分別處理細(xì)胞24，48，72，96h后，采用CCK8方法檢測細(xì)胞增殖；并用Giemsa染色檢測細(xì)胞分化；另以RT-PCR方法檢測DYS對Baf3細(xì)胞IL-3受體及對32D細(xì)胞c-kit表達(dá)水平的影響。結(jié)果：DYS單獨(dú)處理細(xì)胞48h，明顯促進(jìn)Baf3細(xì)胞和32D細(xì)胞增殖；與對照細(xì)胞比較，DYS處理32D細(xì)胞呈現(xiàn)成簇生長并形成許多大的細(xì)胞團(tuán)；在加入IL-3的條件下，DYS也能明顯增強(qiáng)IL-3的促細(xì)胞增殖作用。此外，DYS高濃度單獨(dú)處理32D細(xì)胞可明顯誘導(dǎo)多倍體巨核細(xì)胞數(shù)增加，促進(jìn)巨核細(xì)胞分化。在mRNA水平，DYS單獨(dú)處理細(xì)胞也能明顯上調(diào)IL-3受體和c-kit的表達(dá)。結(jié)論：地榆總皂苷單獨(dú)作用能促使2種巨核祖細(xì)胞的增殖和分化，其作用與上調(diào)IL-3受體和c-kit表達(dá)水平有關(guān)。

　　[關(guān)鍵詞]藥學(xué)期刊發(fā)表論文,地榆總皂苷,造血細(xì)胞增殖,巨核細(xì)胞分化,白細(xì)胞介素3,白細(xì)胞介素3受體,干細(xì)胞因子受體

　　Baf3/Mpl細(xì)胞源自于小鼠髓系巨核祖細(xì)胞系Baf3，后者依賴IL-3生長。通過轉(zhuǎn)入TPOR后，Baf3細(xì)胞也可依賴TPO生長，因此命名為Baf3/Mpl細(xì)胞。盡管已證實(shí)DYS單獨(dú)能促進(jìn)Baf3/Mpl細(xì)胞增殖，且與上調(diào)TPO受體表達(dá)水平有關(guān)，但Baf3/Mpl細(xì)胞也表達(dá)IL-3受體，DYS的促增殖作用與IL-3受體是否也有關(guān)聯(lián)，尚值得進(jìn)一步探索。本研究采用未經(jīng)Mpl受體轉(zhuǎn)染的Baf3親本細(xì)胞在加入或缺乏IL-3的體外培養(yǎng)條件下，觀察地榆總皂苷對細(xì)胞生長的影響，同時(shí)研究了地榆總皂苷對IL-3受體表達(dá)的影響；另選擇了依賴IL-3生長的32D小鼠髓系祖細(xì)胞系，研究了地榆總皂苷的促增殖作用，并觀察了DYS誘導(dǎo)巨核細(xì)胞分化的作用以及對干細(xì)胞因子受體c-kit表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探索促造血的多效性奠定基礎(chǔ)。

　　1材料

　　1.1地榆總皂苷制備取干燥地榆（購自成都市五塊石藥材市場，并由成都中醫(yī)藥大學(xué)賈敏如教授鑒定為地榆SanguisorbaofficinalisL.）粉碎成粗粉，稱取500g并加入10倍量95%乙醇浸泡30min，回流提取3次，每次60min，尼龍布過濾；合并提取液，減壓過濾得透明微紅色液體，減壓回收乙醇，加水混懸，保溫至60℃，乙酸乙酯趁熱萃取，連續(xù)3次，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯，即得地榆總皂苷粗提物。HPLC測定地榆皂苷I質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于70%。使用前用DMSO溶解，無菌PBS稀釋至1g・L-1，待用。

　　1.2試劑與儀器RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco）；新生胎牛血清（HyClone）；重組小鼠白介素3（mIL-3，Sigma公司）；一步法RT-PCR試劑盒（Takara）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Sanyo公司）；普通光學(xué)顯微鏡和倒置相差顯微鏡（Olympus公司）；多功能酶標(biāo)儀（PerkinElmer公司）。

　　2方法

　　2.1細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)依賴IL-3生長的Baf3細(xì)胞和32D細(xì)胞系均購買自ATCC。細(xì)胞采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，IL-3（2μg・L-1）參照說明補(bǔ)充加入培養(yǎng)體系中。

　　2.2細(xì)胞增殖測定Baf3和32D細(xì)胞維持培養(yǎng)在對數(shù)生長期，用無血清培養(yǎng)基洗滌3次，懸浮于含0.5%胎牛血清的無細(xì)胞因子培養(yǎng)基中，次日以適量細(xì)胞數(shù)分別接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，分別設(shè)置空白對照組、地榆總皂苷單獨(dú)處理組、IL-3單獨(dú)處理組、地榆總皂苷+IL-3處理組。用無IL-3、無血清培養(yǎng)基稀釋地榆總皂苷溶液，按照設(shè)置濃度加入細(xì)胞，使其終質(zhì)量濃度分別為5，10，20，30，40mg・L-1，IL-3濃度參照細(xì)胞維持生長所需濃度加入。細(xì)胞在37℃條件下連續(xù)培養(yǎng)至指定時(shí)間，采用CCK8試劑盒并參照說明書提供的方法進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測。

　　2.3Giemsa染色和巨核細(xì)胞計(jì)數(shù)Baf3和32D細(xì)胞分別接種于6孔板中，采用較高質(zhì)量濃度（40mg・L-1）的DYS分別處理2種細(xì)胞，Baf3細(xì)胞在DYS處理120h后涂片用甲醇固定5min，Giemsa染色10min，染色后的標(biāo)本用緩沖液洗滌，晾干，顯微鏡觀察其形態(tài)學(xué)變化；32D細(xì)胞在DYS處理9d后光學(xué)顯微鏡下以細(xì)胞核內(nèi)分裂分類計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的多倍體巨核細(xì)胞數(shù)，分類以雙核為4N，4核為8N，依此類推。

　　2.4RT-PCR檢測Baf3細(xì)胞和32D細(xì)胞分別接種在6孔培養(yǎng)板，加入地榆總皂苷溶液（10mg・L-1），37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24，48，72h收獲細(xì)胞，用Trizol試劑提取總RNA。參照RT-PCR試劑盒擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的基因，各基因引物均由作者設(shè)計(jì)，上海基康生物技術(shù)有限公司合成，引物序列及產(chǎn)物片段大小見表1。IL-3R與c-kit擴(kuò)增條件均為逆轉(zhuǎn)錄（RT）：50℃30min；94℃2min；PCR擴(kuò)增條件：94℃15s，48℃15s，72℃45s，24～26個(gè)循環(huán)；最后延伸72℃10min，4℃1h。同時(shí)設(shè)置內(nèi)參基因GAPDH的擴(kuò)增，循環(huán)數(shù)為24，其余同目的基因擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并拍照，同時(shí)采用半定量方法（目的基因/GAPDH）計(jì)算目的基因表達(dá)水平。2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。

　　3結(jié)果

　　3.1DYS對Baf3細(xì)胞增殖的影響B(tài)af3細(xì)胞在缺乏IL-3培養(yǎng)條件時(shí)，細(xì)胞增殖明顯受抑制，但在含IL-3的培養(yǎng)條件下，Baf3細(xì)胞增殖明顯，證實(shí)Baf3細(xì)胞依賴IL-3生長；在不含IL-3的培養(yǎng)條件下加入DYS（10mg・L-1）后，Baf3細(xì)胞數(shù)量也明顯增加，并呈時(shí)間依賴；在含IL-3的培養(yǎng)條件下加入DYS（10mg・L-1），Baf3細(xì)胞數(shù)量增加更為明顯，并優(yōu)于IL-3單獨(dú)刺激的細(xì)胞增殖結(jié)果。為了證實(shí)DYS的濃度依賴關(guān)系，進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示：在不加IL-3的條件下，DYS促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用僅在20mg・L-1范圍內(nèi)，超過此濃度范圍，細(xì)胞增殖減弱并呈現(xiàn)抑制細(xì)胞增殖的作用，但觀察到細(xì)胞胞體變大的現(xiàn)象，見圖1。

　　3.2DYS對32D細(xì)胞增殖的影響另采用依賴IL-3生長的32D細(xì)胞，證實(shí)了DYS促細(xì)胞增殖的作用。32D細(xì)胞在缺乏IL-3培養(yǎng)條件時(shí)，細(xì)胞增殖明顯受抑制，但在含IL-3的培養(yǎng)條件下，32D細(xì)胞增殖明顯，證實(shí)32D細(xì)胞依賴IL-3生長；在不含IL-3的培養(yǎng)條件下加入DYS（10mg・L-1）后，32D細(xì)胞數(shù)量明顯增加，并呈時(shí)間依賴，此結(jié)果與在Baf3細(xì)胞中觀察到的結(jié)果一致，見圖2。

　　32D細(xì)胞依賴IL-3生長，加入IL-3后，細(xì)胞快速增殖并聚集成簇，形成明顯的細(xì)胞團(tuán)，該成簇生長的特征反映了32D細(xì)胞增殖的最佳狀態(tài)。通過32D細(xì)胞加入IL-3后成簇生長的特征，評價(jià)了DYS單獨(dú)促32D細(xì)胞增殖的能力。對照細(xì)胞在缺乏IL-3或DYS的條件下，細(xì)胞逐漸死亡，在培養(yǎng)第9天，僅有單個(gè)散在的活細(xì)胞存在，且數(shù)量非常有限；而加入DYS的細(xì)胞明顯聚集成簇，與IL-3加入后形成的細(xì)胞團(tuán)相同，但聚集成簇的細(xì)胞團(tuán)略小于加入IL-3的細(xì)胞，此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了DYS的促造血生長作用，見圖3。

　　3.3DYS對32D細(xì)胞分化的影響為了證實(shí)DYS誘導(dǎo)巨核細(xì)胞分化的作用，在缺乏IL-3的培養(yǎng)條件下，采用20mg・L-1的DYS單獨(dú)處理細(xì)胞，在第4天和第9天經(jīng)Giemsa染色，見圖4，結(jié)果顯示：與培養(yǎng)第4天的對照細(xì)胞相比，DYS單獨(dú)處理細(xì)胞后第4天，多倍體巨核細(xì)胞數(shù)量增加，且胞體變大；培養(yǎng)至第9天細(xì)胞大部分死亡，僅剩胞體變大的細(xì)胞。經(jīng)Giemsa染色并記錄不同倍體巨核細(xì)胞的百分率，結(jié)果顯示：在缺乏IL-3的條件下培養(yǎng)9d，2N細(xì)胞幾乎全部死亡，4～32N巨核細(xì)胞數(shù)明顯增加，DYS處理細(xì)胞中的4N細(xì)胞明顯減少，但8～32N細(xì)胞明顯增加，其中16N細(xì)胞增加尤其明顯，為對照細(xì)胞的2.3倍。此結(jié)果初步證實(shí)地榆具有促進(jìn)巨核祖細(xì)胞成熟分化的作用，見圖5。

　　3.4DYS對Baf3細(xì)胞mIL-3受體表達(dá)水平的影響B(tài)af3細(xì)胞表達(dá)mIL-3受體并依賴IL-3生長，DYS是否能上調(diào)mIL-3受體的表達(dá)，值得進(jìn)一步研究。采用RT-PCR技術(shù)，研究了地榆總皂苷對IL-3受體mRNA表達(dá)水平的影響，結(jié)果顯示，DYS單獨(dú)處理Baf3細(xì)胞48h后，IL-3受體mRNA水平明顯增加，但72h后下降至對照水平，見圖6。

　　3.5DYS對32D細(xì)胞c-kit表達(dá)水平的影響c-kit為干細(xì)胞因子受體，在巨核祖細(xì)胞向成熟分化過程中發(fā)揮了重要作用。因此，進(jìn)一步檢測了DYS對32D細(xì)胞的c-kit表達(dá)的影響。與對照細(xì)胞比較，DYS單獨(dú)處理細(xì)胞后能明顯上調(diào)c-kit的表達(dá)，此結(jié)果提示地榆總皂苷也能通過上調(diào)巨核祖細(xì)胞c-kit表達(dá)而發(fā)揮促巨核細(xì)胞增殖和分化的作用，見圖6。

　　4討論

　　前期研究發(fā)現(xiàn)地榆總皂苷能單獨(dú)或增強(qiáng)TPO刺激的Baf3/Mpl細(xì)胞增殖，且能顯著增加TPO受體表達(dá)水平。Baf3/Mpl細(xì)胞源自于Baf3細(xì)胞，前者通過轉(zhuǎn)入TPO受體Mpl后依賴TPO因子生長。本研究中，采用了無外源性Mpl表達(dá)并依賴IL-3生長的Baf3細(xì)胞以及依賴IL-3生長的32D細(xì)胞，評價(jià)了地榆總皂苷的促造血增殖作用。在缺乏IL-3的條件下，地榆總皂苷能明顯促進(jìn)Baf3細(xì)胞和32D細(xì)胞增殖，表明DYS可不依賴TPO和IL-3而促進(jìn)巨核祖細(xì)胞的增殖。此外，延長DYS處理32D細(xì)胞的時(shí)間，可明顯增加16～32N巨核細(xì)胞數(shù)量，證實(shí)DYS單獨(dú)處理細(xì)胞不僅可促其增殖，而且具有促其向巨核細(xì)胞成熟分化的作用。

　　早期認(rèn)為，巨核細(xì)胞增殖以及分化成熟主要受巨核細(xì)胞祖細(xì)胞集落刺激因子（MK-CSF）和促血小板生成素（TPO）的雙水平調(diào)節(jié)。隨后對小鼠和人類巨核細(xì)胞的體外研究表明，巨核細(xì)胞生成受多種體液因子的多水平調(diào)節(jié)，包括IL-3，IL-6和EPO細(xì)胞因子。近來研究證實(shí)，在造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞中，干細(xì)胞因子（SCF）及其受體c-kit對巨核細(xì)胞增殖、分化和產(chǎn)生血小板的影響較其他細(xì)胞更為顯著[3-4]。DYS促進(jìn)巨核祖細(xì)胞增殖以及分化的作用可能與其他受體如IL-3受體和c-kit有關(guān)。據(jù)此，進(jìn)一步在mRNA水平研究了DYS對2種受體表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DYS確能上調(diào)2種受體的表達(dá)。

　　IL-3受體屬于Ⅰ型造血細(xì)胞因子受體超家族[5]，由特異性α鏈和β鏈構(gòu)成，其α鏈與IL-3結(jié)合形成低親和受體異二聚體，隨后與β鏈結(jié)合形成高親和受體復(fù)合物，導(dǎo)致β鏈的磷酸化并激活相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[6-8]。IL-3受體主要在骨髓細(xì)胞中表達(dá)，與IL-3結(jié)合后可促進(jìn)多種造血細(xì)胞增殖，包括中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨核細(xì)胞、紅細(xì)胞以及B細(xì)胞[9]。本研究發(fā)現(xiàn)DYS在無外源性IL-3的作用下可促進(jìn)需依賴IL-3生長的2種巨核細(xì)胞增殖，同時(shí)上調(diào)細(xì)胞IL-3R的表達(dá)，這提示DYS可能具有擬IL-3的作用，包括促進(jìn)巨核細(xì)胞等多種造血細(xì)胞的增殖及成熟。另有研究表明，IL-3不僅可直接作用于造血細(xì)胞，還可通過協(xié)同干細(xì)胞因子（SCF）及其受體c-kit，經(jīng)一系列反應(yīng)激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而調(diào)節(jié)骨髓巨核細(xì)胞的增殖與分化。且多篇文獻(xiàn)報(bào)道，激活SCF-c-kit通路在抗腫瘤藥物損傷后的造血恢復(fù)過程中可表現(xiàn)出良好的血小板恢復(fù)作用[3-4]。由此推測DYS對IL-3R和c-kit表達(dá)水平的上調(diào)是其發(fā)揮促巨核祖細(xì)胞增殖和分化的重要機(jī)制之一。同時(shí)，結(jié)合前期研究結(jié)果，DYS可不依賴TPO或IL-3而促進(jìn)Baf3/Mpl，Baf3，32D細(xì)胞生長，表明DYS具有明顯的多效細(xì)胞因子作用。由于本研究中DYS為地榆總皂苷提取物，DYS中除含有地榆皂苷I單體成分外，尚含有多種其他成分，進(jìn)一步區(qū)分DYS中皂苷及非皂苷類成分的作用，尤其研究不同單體成分對巨核祖細(xì)胞增殖及分化的作用將具有更為重要的價(jià)值和意義。

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