【摘要】目的：建立陳香露白露片藥物微生物限度檢查方法。方法：根據該樣品的微生物限度標準，按《中國藥典》2005年版一部附錄微生物限度檢查法的驗證試驗指導原則，用委托廠家3個批號的陳香露白露片藥物進行驗證試驗，以考察確定陳香露白露片藥物微生物限度的檢查方法。首先用常規法進行預試驗，初步考察該樣品對試驗菌檢測的影響，然后根據預試驗結果，用離心沉淀集菌法進行再試驗。結果：常規法試驗時，大腸埃希菌、白色念珠菌的回收率均大于70%，而金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的回收率小于70%，控制菌檢查檢出試驗菌。采用離心沉淀集菌法試驗時，可以有效消除抑菌作用，使金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的回收率大于70%。結論：采用離心沉淀集菌法可以有效消除抑菌作用，簡便、準確。
　　【關鍵詞】微生物限度檢查論文，驗證試驗論文，離心沉淀集菌法論文
　　陳香露白露片藥物是一復方中成藥制劑，由川木香、大黃、石菖蒲、陳皮、甘草、次硝酸鉍、氧化鎂、碳酸氫鈉組成，用于胃潰瘍、糜爛性胃炎、胃酸過多等疾病［1］。《中國藥典》2005年版規定，在進行藥品微生物限度檢查時，應對所用方法進行驗證，以確認所采用的方法適合于該藥品的微生物限度檢查。為此，筆者對陳香露白露片藥物的微生物限度檢查方法進行了驗證試驗。
　　1試驗材料論文
　　1.1樣品
　　
　　陳香露白露片藥物（云南龍發制藥有限公司；規格：100片/瓶；批號：060401、060402、060403）。
　　1.2稀釋劑及培養基
　　
　　pH7.0無菌氯化鈉�驳鞍纂司彌_液、0.9%無菌氯化鈉溶液、TTC營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、膽鹽乳糖培養基、MUG培養基、膽鹽乳糖發酵培養基、營養肉湯培養基、改良馬丁培養基。
　　1.3菌種
　　
　　金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、大腸埃希菌［CMCC（B）44102］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］，均來源于云南省食品藥品檢驗所。
　　2驗證試驗論文
　　2.1試驗菌液的制備
　　
　　接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，置30～35℃培養18～24h，分別取上述培養物1mL，加0.9%無菌氯化鈉溶液9mL，10倍遞增稀釋，取稀釋液1mL，加入到1個平皿中，每種菌的每1個稀釋級平行制備2個平皿，傾注營養瓊脂培養基，置30～35℃培養24～48h，計數，選擇每1mL含菌數為50～100cfu的稀釋級菌懸液，作為驗證試驗用菌懸液。接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，置23～28℃培養24～48h，取上述培養物1mL，加0.9%無菌氯化鈉溶液9mL，10倍遞增稀釋，取稀釋液1mL，加入到1個平皿中，每1個稀釋級平行制備2個平皿，傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，置23～28℃培養72h，計數，選擇每毫升含菌數為50～100cfu的稀釋級菌懸液，作為驗證試驗用菌懸液。
　　2.2供試液的制備
　　
　　從兩瓶樣品中取樣品10g，至滅菌勻漿杯中，加pH7.0無菌氯化鈉�驳鞍纂司彌_液至100mL，經勻漿儀混勻，制成1∶10的供試液。陳香露白露片藥物3個批號樣品同法操作。
　　2.3細菌數、霉菌及酵母菌數計數方法的驗證
　　2.3.1預試驗論文（常規法）
　　
　　（1）試驗組：取1∶10的供試液1mL，加入到1個平皿中，同法制備8個平皿，依次加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的菌懸液1mL（含50～100cfu），每種菌平行制備2個平皿；取1∶100的供試液1mL，加入到1個平皿中，同法制備8個平皿，依次加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的菌懸液1mL（含50～100cfu），每種菌平行制備2個平皿；取1∶1000的供試液1mL，加入到1個平皿中，同法制備8個平皿，依次加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的菌懸液1mL（含50～100cfu），每種菌平行制備2個平皿。含大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的試驗平皿傾注營養瓊脂培養基，置30～35℃培養48h，計數；白色念珠菌的試驗平皿傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，置23～28℃培養72h，計數。
　　
　　（2）菌液組：分別取已制備好的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的菌懸液1mL（含50～100cfu），加入到1個平皿中，每種菌平行制備2個平皿。含金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的試驗平皿傾注營養瓊脂培養基，置30～35℃培養48h，計數；白色念珠菌的試驗平皿傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，置23～28℃培養72h，計數。
　　
　　（3）供試品對照組：取1∶10供試液1mL，加入到1個平皿中，同法制備4個平皿。取1∶100供試液1mL，加入到1個平皿中，同法制備4個平皿。取1∶1000的供試液1mL，加入到1個平皿中，同法制備4個平皿。每一稀釋級中的2個平皿傾注營養瓊脂培養基，置30～35℃培養48h，計數；每一稀釋級中的另2個平皿傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，置23～28℃培養72h，計數。
　　
　　（4）試驗組菌回收率計算：菌回收率（%）=（試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數）∕菌液組平均菌落數。
　　
　　（5）結果：見表1。大腸埃希菌、白色念珠菌在樣品的1∶10、1∶100、1∶1000供試液中回收率均大于70%；金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌在樣品的1∶1000供試液中回收率均大于70%，在樣品的1∶10、1∶100供試液中回收率均小于70%。根據上述情況，筆者采用離心沉淀集菌法進行再試驗。
　　表1陳香露白露片藥物的細菌數、霉菌及酵母菌數常規方法的驗證預試驗結果（略）
　　2.3.2再試驗（離心沉淀集菌法）
　　
　　（1）試驗組：從100mL的1∶10供試液中取上清液10mL，3000r/min離心20min，棄去上清液，留底部集菌液約2mL，加pH7.0無菌氯化鈉�驳鞍纂司彌_液補至10mL，混勻。取其1mL加入到1個平皿中，同法制備4個平皿，依次加入金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的菌懸液1mL（含50～100cfu），每種菌平行制備2個平皿。另取其1mL，加入到9mLpH7.0無菌氯化鈉�驳鞍纂司彌_液中，混勻，即為1∶100供試液。取1∶100供試液1mL加入到1個平
　　皿中，同法制備4個平皿，依次加入金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的菌懸液lmL（含50～100cfu），每種菌平行制備2個平皿。在制備好的平皿中傾注營養瓊脂培養基，置30～35℃培養48h，計數。
　　
　　（2）菌液組：分別取已制備好的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的菌懸液1mL（含50～100cfu），加入到1個平皿中，每種菌平行制備2個平皿，傾注營養瓊脂培養基，置30～35℃培養48h，計數。
　　
　　（3）供試品對照組：取1∶10供試液1mL，加入到1個平皿中，同法制備2個平皿。取1∶100供試液1mL，加入到1個平皿中，同法制備2個平皿。同法制備4個平皿。傾注營養瓊脂培養基，置30～35℃培養48h，計數。
　　
　　（4）試驗組菌回收率計算：菌回收率（%）=（試驗組平均菌落數﹣供試品對照組平均菌落數）∕菌液組平均菌落數
　　
　　（5）結果：見表2。采用離心沉淀集菌法后，可去除供試液對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌作用，使菌回收率大于70%。
　　表2陳香露白露片藥物的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌離心沉淀集菌法的驗證試驗結果（略）
　　2.4控制菌檢查方法的驗證
　　2.4.1大腸埃希菌檢查方法的驗證
　　
　　（1）試驗組：取1∶10供試液10mL和大腸埃希菌的菌懸液1mL（含50～100cfu），加入到膽鹽乳糖增菌液100mL中，置35～37℃培養18～24h，按《中國藥典》2005年版一部附錄微生物限度檢查法中的大腸埃希菌檢查法進行檢查。
　　
　　（2）陰性對照組：取1∶10供試液10mL和金黃色葡萄球菌的菌懸液1mL（含50～100cfu），加入到膽鹽乳糖增菌液100mL中，置35～37℃培養18～24h，按《中國藥典》2005年版一部附錄微生物限度檢查法中的大腸埃希菌檢查法進行檢查。
　　
　　（3）供試品對照組：取1∶10供試液10mL，加入到膽鹽乳糖增菌液100mL中，置35～37℃培養18～24h，按《中國藥典》2005年版一部附錄微生物限度檢查法中的大腸埃希菌檢查法進行檢查。
　　
　　（4）結果：試驗組檢出大腸埃希菌，陰性菌對照組結果為陰性，供試品對照組未檢出大腸埃希菌。
　　2.4.2大腸菌群檢查方法的驗證
　　
　　（1）試驗組：取1∶10、1∶100、1∶1000供試液各1mL和大腸埃希菌的菌懸液1mL（含50～100cfu），加入到3支膽鹽乳糖發酵培養液中，置35～37℃培養18～24h，按《中國藥典》2005年版一部附錄微生物限度檢查法中的大腸菌群檢查法進行檢查。
　　
　　（2）陰性對照組：取1∶10、1∶100、1∶1000供試液各1mL和金黃色葡萄球菌的菌懸液1mL（含50～100cfu），加入到3支膽鹽乳糖發酵培養液中，置35～37℃培養18～24h，按《中國藥典》2005版一部附錄微生物限度檢查法中的大腸菌群檢查法進行檢查。
　　
　　（3）供試品對照組：取1∶10、1∶100、1∶1000供試液各1mL，加入到3支膽鹽乳糖發酵培養液中，置35～37℃培養18～24h，按《中國藥典》2005版一部附錄微生物限度檢查法中的大腸菌群檢查法進行檢查。
　　
　　（4）結果：試驗組檢出大腸菌群，陰性菌對照組結果為陰性，供試品對照組未檢出大腸菌群。
　　3討論
　　
　　采用常規法試驗時，該樣品對大腸埃希菌、白色念珠菌的加菌回收率均大于70%，證明其對上述2種供試菌無抑菌作用。該樣品對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有抑菌作用，在1∶10、1∶100的稀釋級，其加菌回收率小于70%，低于《中國藥典》2005年版規定的回收率不得低于70%才視為無抑菌作用的要求。結合該樣品的物理特性和常規法試驗結果，采用離心沉淀集菌法進行試驗后，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的加菌回收率可大于70%。故陳香露白露片藥物的細菌數檢查可采用離心沉淀集菌法，霉菌及酵母菌數的檢查采用常規法。
　　
　　由控制菌檢查方法的驗證試驗結果表明，采用常規法試驗時，該樣品對大腸埃希菌、大腸菌群的檢查無干擾，故陳香露白露片藥物的控制菌檢查可采用常規法。
　　
　　因安全原因，黑曲霉［CMCC（F）98003］的驗證試驗未進行。
　　【參考文獻】
　　［1］衛生部藥典委員會.衛生部藥品標準.中藥成方制劑(第八冊)［S］.北京：人民衛生出版社，1993:87.